Tecnologie del DNA ricombinante

Partendo da un campione di pGEM-7zf(+), abbiamo valutato la sua concentrazione con metodi spettrofotometrici e attraverso elettroforesi (con confronto tra plasmide a cui è stata effettuata una reazione di linearizazzione ed osservazione di diverse forme di superavvolgimento nel plasmide non tagliato).
Se da una parte abbiamo reso le cellule di E. coli competenti, osservando che erano in fase esponenziale, dall'altra abbiamo ligato un frammento di DNA con il plasmide pGEM-7zf(+) linearizzato (osservando anche la reazione con fosfatasi alcalina), poi confermato attraverso elettroforesi su gel di agarosio. Trasformazione delle cellule competenti con il plasmide ingegnerizzato e non, preparazione di miniculture, ed osservazione dell'efficienza di trasformazione.
Amplificazione dei trasformanti (attraverso crescita su terreno liquido dei batteri trasformati), estrazione plasmidica ed analisi con costruzione di una mappa di siti di restrizione.
Abbiamo poi proseguito con la sequenziazione attraverso il metodo di Ranger (con un fluorocromo) dell'inserto, sfruttando un Cycle sequencing. Dati poi processati con BLAST e applicazioni internet, per l'analisi e l'identificazione del sequenziato (in forward e riverse).
Attraverso un'estrazione cromosomica in lievito, cromosoma in cui un allele di un gene era stato sostituito da una porzione non codificante, e successivamente una PCR con opportuni primer, è stato osservato l'effettiva presenza o meno del mutante nella porzione in oggetto di studio (in cui doveva esserci stata la mutazione.
Abbiamo anche eseguito, un'estrazione proteica, cromatografia per affinità di una proteina di fusione, e sua comparazione in tecniche di separazione come SDS-PAG e West Blotting, con un estratto grezzo.