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Fosfatasi alcalina
È una fosfomonoesterasi, in grado di togliere
il fosfato da un nick in condizioni di leggera denaturazione. Togliendo
il P, lascia un OH. Si tratta di una reazione rapida che avviene
a temperatura ambiente.
Uso:
Per rimuovere il P dopo il taglio con endonucleasi, così poi uso
una chinasi con P* per fare sonde.
Per impedire la self ligation del plasmide (la sua chiusura).
Chinasi
La più usata è quella di T4. Attacca un P in 5’-OH
di RNA o DNA sia ss che ds, con specificità diverse! Richiede ATP
e MG++ e può dare due reazioni.
Forward reaction: è una normale fosforilazione
al 5’-OH. Usando 32P-γ-ATP* ottengo un polinucleotide
marcato al 5’.
Exchange reaction: in eccesso di ADP
trasferisce dapprima il fosfato in 5’ sull’ADP, e poi fosforila
usando ATP il 5’-OH. In genere il 5’ protruding è più facilmente
attaccato del 3’.
Uso:
. sequenziamento chimico del DNA
. marcatura del DNA
Ligasi
Riforma il legame fosfodiesterico di un filamento nickato o di estremità compatibili (3’ o 5’ protruding, blunt).
Ci sono diverse ligasi. Quella di E.coli (cofattore NAD) non si
usa anche perché non agisce sulle blunt ends. Viene
usata la ligasi del fago T4 che richiede ATP e Mg++.
La richiesta di uno ione bivalente mi permette
di fermare la reazione ligasica aggiungendo alla miscela di ligazione
un chelante (EDTA).
Lavora sia su blunt che su protruding, ma con efficienza diversa:
- Km protruding
= 0.6 uM
- Km blunt
= 50.0 uM
Per aumentare l’efficienza di ligazione (soprattutto blunt ends) posso
- aggiungere PEG che sottraendo molecole di H2O
favorisce legami inter-intra molecolari.
- aggiungere Co++.
- si lavora a temp. più basse dell’optimum (25-37
°C) per minimizzare i moti convettivi e rendere più efficaci
gli urti intermolecolari.
Meccanismo d’azione della ligasi.
L’enzima attivato lega sull’NH2 del estremità amminoterminale
un AMP che viene trasferito al gruppo fosfato in 5’ attivandolo
e rendendolo suscettibile di attacco nucleofilo da parte del 3’-OH.
Attacco che avviene con liberazione di AMP e formazione del legame
transestere.
- Un plasmide aperto con estremità compatibili (un
taglio in un sito di restrizione unico per esempio) e suscettibile
di self ligation che abbassa la percentuale di plasmidi ricombinanti
utili ai fini del clonaggio. Per prevenire il problema si usa
la fosfatasi alcalina che defosforila... come sappiam già.
- La ligasi è utilizzata anche per attaccare linker
portanti siti di restrizione utili al clonaggio a inserti di
DNA con blunt ends.
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