-4° Giorno-
Ligazione del plasmide e trasformazione cellule E. coli

Procedimento:
Ligazione del plasmide, tagliato con XbaI, con un frammento di DNA, dopo la reazione, una parte dei plasmidi viene trattata con fosfatasi alcalina. Trasformazione delle cellule competenti del giorno prima con il prodotto di ligazione. Realizzazione di piastre con le cellule così trasformate

Note, risultati e conclusioni:
Nella ligazione che effettuiamo tra il plasmide pGEM 7Zf e un inserto fornito, osserviamo anche l'attività della fosfatasi alcalina. Questa, infatti, defosforilando gli OH presenti in 3' del plasmide, linearizzato con XbaI non permette che questo dei richiudi su stesso. Reazione di ligasi che avviene con la DNA ligasi del fago T4.

In condizioni di sterilità effettuiamo poi la trasformazione delle cellule rese competenti il giorno prima.
Usando il CaCl2 per rendere competenti le cellule di E. coli abbiamo una efficienza di 106 trasformanti / µg di plasmide. Altre tecniche come l'elettroporazione, permettono di avere efficienza maggiori.
Per piastrare adottiamo questo schema, il quale ci permetterà di osservare i risultati di ligazione e di contare più comodamente le colonie: