Abbiam visto il lievito per fare gene targeting, per fare attivazione, per studiare geni omologhi di sistemi più complessi, per lo studio di interazioni proteina-proteina o anche per clonare proteine e quindi clonare geni che interagiscono fra di loro.
Esiste un altro argomento che riguarda l’espressione di geni. Non prenderemo in considerazione tutti gli organismi e tutti i vettori di espressione esistenti, ma vedremo solo cosa devono avere in comune i vettori d’espressione.
Tutti devono avere una parte relativa a E.Coli che permetta quindi replicazione e selezione con marcatori di selezione. in più devono avere una parte che dipenderà dall’organismo in cui io decido di esprimereil gene x, quindi un marcatore di selezione e un sistema che permetta nell’organismo in questione la replicax autonoma se o dove è possibile.
Tutti poi hanno quella che è una cassetta di espressione, in cui ci dev’essere un sito di clonaggio in cui io posso clonare YFG, inoltre questa cassetta deve contenere elementi importanti, sia in 5’ che in 3’: io voglio che questo gene sia tracritto, che l’RNA sia stabile, dopodiché io voglio che si abbia traduzione all’interno dell’organismo (verme o pianta o topo o uomo o marziano). Per cui avrò in 5’ gli elementi che controllano trascr e trad e in 3’ segnali di terminazione della trascr, di poliadenilazione e, eventualmente, di splicing. questi elementi dipenderanno dall’organismo in cui io voglio esprimere YFG.

Promotori.
Possono essere costitutivi o inducibili. In genere i promotori costitutivi sono quelli della via glicolitica: (enolasi ecc.), promotori inducibili sono il classico Gal o altro. I promotori possono essere poi forti o deboli. Ho quindi un primo controllo a livello trascrizionale, scelgo il tipo di promotore: costitivo o inducibile: in genere quindio esprimo q.cosa volgio averne tanto. E il fatto di produrne tanto (accumulo) non è che faccia così bene alla cellula (limita la crescita). Quindi scelgo un promotore inducibile: prima faccio crescere le cellule a promotore spento, poi, quando ho raggiunto una certa biomassa, accendo il sistema.

Controlli:
I segnali di terminazione in 3’, sono importanti: mi interessa avere tanto messaggero stabile.
Un altro controllo è a livello traduzionale: devo avere una buona traduzione, quindi devo metterci i giusti segnali. devo avere una corretta lettura (-->codice degenerato con uso preferenziale dei codoni). Non è vero che il codice è universale: la bestiolina di nome Candida Albicans quando trova CUG (normalmente Leu) fa Ser. Quindi una proteina di Candida espressa in lievito può essere non funzionale, e viceversa.
Una volta che ho tradotto il prodotto deve essere stabile, nella maggior parte dei casi si usano ceppi proteasi negativi, e a riguardo avevamo già visto E.Coli con la mutazione (?Lam?).
Molto spesso poi la proteina va incontro a modificazioni post-traduzionali: fosforilazione, glicosilazione, acetilazione, acilazione, formax di ponti disolfuro, mistirilazione, gipilazione, ecc…
Io devo essere certo che l’organismo che scelgo faccia queste modificazioni. La maggior parte di queste modificazioni avvengono lungo la via secretiva, i ponti di solfuro si formano a livello di reticolo endoplasmico, che E.Coli non ha. Per poter essere indirizzata lungo la via secretiva io devo aggiungere alla mia cassetta di espressione un ulteriore elemento che è la “leader sequence”, per cui ci sono dei vettori che oltre alla zona 5’ (promotore) hanno questa sequenza lunga circa da 15 a 30 aminoacidi il cui core centrale ha caratteristiche idrofobiche, e la parte N-term. è costituita da aa carichi. Questa sequenza è essenziale per la traslocazione a livello del reticolo, dopodiché viene rimossa (leader peptidasi). Ovviamente il promotore e la sequenza segnale devono essere in frame. (cfr le scienze di agosto)
Di leader sequences ne esistono diverse, nel caso del lievito viene utilizzata spesso la sequenza segnale dell’(a)-factor, una proteina fatta lungo la via secretiva prima di essere immessa nel medium, ed è quindi caratterizzata da una leader sequenza.