(dott. Ivan Orlandi).

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di sequenza. È necessario che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, e che una piccola quantità della sequenza sia disponibile per dare inizio alla reazione. Non è necessario che la sequenza da sintetizzare enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; essa può anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa, come un segmento di un gene a singola copia nel DNA totale umano. La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle 5’ degli oligomeri utilizzati.

Un tipico ciclo di PCR:
1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che deve essere copiato (94 – 99 °C)
2. Appaiamento (annealing) di coppie di oligo, (30 – 65 °C)
3. Estensione da parte di DNApol termoresistente a partire dai primer. (65 – 72 °C)

La scelta delle condizioni operative del ciclo (tempo e temperatura) è compito dell’operatore, è una scelta empirica e non prefissata.
Un passaggio graduale tra la temperatura di annealing e la temperatura di estensione permette alla Taq di iniziare l’elongazione senza che i primers si stacchino (T>Tm). Via via che la Taq polimerizza la Temperatura supera i 72 °C e rincomincia il ciclo con la denaturazione.
Durante il primo ed ogni successivo ciclo di reazione, l’estensione di ogni oligonucleotide sullo stampo originale produrrà una nuova molecola di ssDNA di lunghezza indefinita. “Questi prodotti lunghi” si accumuleranno in maniera lineare, cioè la loro quantità dopo un numero qualsiasi di cicli sarà linearmente proporzionale allo stesso numero di cicli. I “prodotti lunghi” originati in questo modo fungeranno da stampi per l’uno o l’altro degli oligonucleotidi durante i cicli succcessivi, e l’estensione di questi oligonucleotidi dalla polimerasi produrrà molecole di una lunghezza definita, corrispondente a quella della sostanza di interesse. Queste molecole fungeranno anch’esse come stampi per l’uno o per l’altro oligonucleotide producendo altre molecole di grandezza definita. In questo modo si svilupperà una reazione a catena che porterà all’accumulo di uno specifico dsDNA in maniera esponenziale rispetto al numero di cicli di reazione. Il grado di amplificazione finale è dato da 2^(n-2) dato che i primi due cicli sono nulli.

REAGENTI PER LA PCR.
Templato
I risultati migliori si ottengono con frammenti non superiori a 1.5 kb. Il numero di cicli non deve superare la cinquantina, poiché dopo un certo numero di cicli l’amplificazione non è più esponenziale ma raggiunge un plateau dovuto a:
1. carenza di oligo,
2. carenza di dNTP,
3. aumento di PP_i,
4. comparsa di DNA parassita amplificato.
Se la sequenza è ricca di GC si aggiunge DMSO (Dimetil Solfuro) e si usa la 7-aza-dGTP al posto del dGTP, ponendo attenzione che questo non inibisca la DNA polimerasi.

Il templato può essere:
1. Omogeneo (plasmide purificato) ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza da amplificare, il vantaggio è che poche molecole bastano a garantire l’amplificazione
2. Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o materiale biologico) Devo usare molto DNA per avere un minimo sufficiente per garantire l’amplificazione.
Anche la purezza e il materiale di partenza contano: l’enzima può subire o meno impedimento sterico per raggiungere il templato. In questi casi, caso per caso si introducono accorgimenti particolari atti a minimizzare il disturbo.
In generale bisogna evitare tutti i contaminanti chimici che non permettano l’attività polimerasica efficace.
Alla fine dell’estrazione dobbiamo tirare via tutto: EDTA chela il Mg⁺⁺, indispensabile per le polimerasi; gli ac.forti, i sali che potrebbero fare complessi nel sito attivo dell’enzima e inibirlo e, in linea teorica tutte le sostanze che interferiscono con l’attività enzimatica (sono tutte scritte sulla boccettina di enzima) se fra i non desiderati c’è qualcosa che è stato usato per separare il DNA, andrà eliminato sicuramente.