Per ottenere un gene devo partire da un tessuto, un organo o un ammasso di cellule, da questi posso avere tre cose:
. DNA,
. RNA totali (da cui posso ricavare l'RNA messagero),
. proteine totali (proteina purificata x -tramite uso di anticorpi per il suo riconoscimento-).
Conoscendo le zone fiancheggianti al gene di interesse posso costruirmi un oligonucleotide e isolare il mio gene. Posso anche derivarlo partendo dal gene omologo a quello cercato, ma presente (e identificato) su un'altra specie: la PCR sarà svolta in condizioni non troppo strette di annealing.
Volendo posso però costruirmi delle banche, o delle genoteche: ossia avere tutta una serie di cloni ricombinanti che sono rappresentativi dell’intero genoma di un certo organismo, in questo modo ho tutto il genoma di un organismo clonato in opportuni vettori.
Ci sono 2 tipi di banche, a seconda che il genoma di partenza abbia o no gli introni.
Senza introni estraggo il DNA genomico e costruisco banche genomiche, se ho introni (mammifero) estraggo gli RNA totali, isolo i messaggeri e ricavo con la trascrittasi inversa il cDNA, con questo costruisco una banca a cDNA.
Una volta che ho trasformato Coli, e ho il materiale su cui lavorare, un po’ di colonie trasformate contenenti il gene clonato le uso per caratterizzare il gene (screening) e in parte amplifico la cultura e la conservo a –80°C (storage).
Passando attraverso il cDNA non ho più una rappresentitività numerica dei geni della cellula, ma ho un arricchimento: certi geni sono espressi più di altri, e questi saranno amplificati di più, a seconda del tessuto e delle condizioni originarie del tessuto prima che arrivasse in laboratorio.
Per screenare le banche ci sono diversi metodi, il punto di partenza è che devo avere una sonda specifica per quello che vado a marcare. In entrambi i casi io arrivo all’isolamento del gene. Nel caso in cui avessi solo la proteina purificata esistono metodi di sequenziamento delle proteine da cui posso costruirmi un gene sintetico, tenendo conto di tutti i fattori (sonde di Guessmer: oligo sonda di circa 20nucleotidi - circa 7 amminoacidi- che tiene conto del codice degenerato, scegliendo una regione proteica che contenga il numero minimo di codoni degenerati ), oppure posso farmi degli anticorpi, che mi servono per screenare le banche ad espressione.
Ottenuto il gene, lo sequenzio e ci posso fare tutti gli studi che voglio: studiare il 3’, studiare il 5’, studiare com’è regolato durante il ciclo, studiare quando è espresso, ecc., con vari passaggi diversi a seconda del tipo di biotecnologia (industriale, farmaceutica…). In tutti i casi quello che interessa a tutti è, dopo aver isolato il gene, produrre in grosse quantità la proteina (così la purifico bene e la studio) e a seconda del prodotto potrò avere trials clinici o processi migliorativi industriali.

Per allestire le librerie genomiche dal cDNA parto dalle cellule e arrivo alla scelta del vettore (in funzione della dimensione dei frammenti genici),
estraggo il DNA e lo digerisco (così com’è non può essere clonato 10⁸bp!), stando attento che la banca che vado a costruire sia rappresentativa di tutto il genoma, frammentando il meno possibile tra i geni (digestioni parziali seriali).
Una volta che l’ho digerito posso o clonarlo tutto o selezionare solo frammenti di alcune dimensioni (size fractionation). Quindi clono il tutto.
E’ ovvio che nella banca a cDNA non devo frammentare i messaggeri! In questi casi i cDNA non hanno estremità con siti di restrizione, quindi devo aggiungo dei linker (un po’ come la PCR), ma prima di fare questo devo metilare il cDNA, altrimenti mi si spezzetta tutto, infatti io non conosco la sequenza e non conosco la mappa di restrizione.
Una volta clonati o trasformo Coli coi plasmidi o faccio il packaging con i fagi.
Il passaggio successivo è la caratterizzazione della banca: devo sapere veramente cosa c’è nei miei vettori percui una volta trasformato estraggo il DNA ricombinante da Coli e lo caratterizzo (ottengo la mappa di restrizione per avere un’indicazione delle dimensioni).
Ora devo titolare la banca: devo sapere, usando un certo quantitativo di dna e di cellule di coli quanti cloni ricombinanti ottengo (devo sapere la resa). Perché? perché devo sapere quando screeno un gene quanti cloni ricombinanti devo analizzare per essere sicuro di trovare il gene che più mi interessa (più il genoma è complesso più ho cloni da analizzare) e per avere la probabilità dalla mia parte ne analizzarò un po’ di più. Questo vale anche per i frammenti: più sono piccoli e più analisi devo fare.
Ora da una parte faccio lo screening, dall’altro lo storage (con tanto di amplificazione di quello che mi rimane: se ho fagi, ne uso un po’ per trasformare Coli, se ho i plasmidi, faccio crescere coli, piastro , raccolgo e metto via), In questii passaggi di amplificazione devo pure tener conto del fatto che i geni esogeni potrebbero essere tossici per l’ospite. Magari al primo passaggio l’ospite conserva l’esoDNA, ma successivamente tende a perderlo. Devo stare molto attento: potrei arricchire certi geni o perderli.
C’è una formula, derivata dalla legge di Poisson, che mi permette di calcolare il n° di cloni che io devo analizzare per avere una certa probabilità di trovare il gene di mio interesse. Il numero di cloni da analizzare cresce con:
1. la probabilità che io voglio di trovare il gene di mio interesse;
2. la complessità del genoma dell’organismo di cui ha fatto la banca;
3. la piccolezza dei frammenti di DNA clonati nell’organismo ospite

Nel caso del genoma umano (3x10⁹ bp), ammettendo di avere dimensioni medie dei frammenti clonati 2x10⁴, e ammettendo di volrere la probabilità del 90% di trovare il frammento x, il risultato è che io devo screenare almeno 690.000 cloni, isolati ed indipendenti. Immaginare un po’ quante piastre bisogna preparare!
C’è pure una formula un po’ più veloce ed empirica: il numero di cloni da saggiare è uguale a 5 per il rapporto fra le dimensioni del genoma e le dimensioni dei frammenti.

Devo costruire la mia banca cercando di rappresentare tutto il genoma. La miscela deve essere casuale(metodo non riproducibile), quindi non devo tagliare favorendo frammenti grandi o piccoli, ed inoltre devo donar loro estremità coesive. Uso allora enzimi di restrizione di tipoII. Questi enzimi riconoscono 4, 6, 8, n bp, se ne uso uno da n, mi darà 4ⁿ paia di basi per frammento. Teniamo conto che non devono essere troppo piccolo e che i vettori hanno un limite.
In genere si preferiscono quelli che riconoscono 4 bp con digestioni parziali (la parziale è necessaria), inoltre mi dà una distruibuzione più casuale (ho più possibilità di configurazione). Se facessi digestioni totali taglierei pezzetti di un gene in cloni diversi, e come faccio a ricostruire il tutto? Invece con le parziali posso fare il “chromosome walking”: tutti i siti non verranno tagliati con la stessa velocità (uso [limitanti] o scarsità di tempo), il tutto è molto riproducibile, perché il taglio dipende dall’intorno del sito di restrizione (--> overlapping), che è sempre lo stesso.

Chromosome Walking
Impiega un fago ricombinante dal quale isolare un altro fago che contenga informazioni relative al genoma sovrapponibili (overlap).
Basta preparare due sonde derivate una dall’estremo 5’ e l’altra dall’estremo 3’ di questo primo coli e ripetere con queste sonde lo screening della genoteca.
Si otterranno altri cloni.
Se ne sceglieranno due tra quelli diversi dal primo, uno più spostato al 3’; l’altro più spostato al 5’.
Dal clone “3’” si prepara una sonda presente al suo estremo 3’, e dal clone 5’ una sonda presente al suo 5’. e pronti per un altro screening e così via, camminando sul cromosoma.
Limiti. I piccoli segmenti di DNA utilizzati per vagliare di nuovo la genoteca devono essere rappresentati una sola volta nel genoma: ci sono problemi col DNA ripetuto, il rischio è di saltare da un cromosoma all’altro.