PCR ASIMMETRICA.
Possiamo fare una PCR in cui alla fine abbiamo un prodotto ss (single strand). È un amplificazione parziale, e quindi non è più esponenziale… Ad un certo tempo la sintesi di uno dei due filamenti diventa limitante: A continua ad aumentare, B fa fatica (quasi costante).
Il vantaggio di questa tecnica:
1. nella preparazione di sonde (identificazione dei messaggeri);
2. sequenziamento.
Non è corretto parlare di amplificato, perché nei primi cicli non tutti i prodotti diventano templato per i successivi: dopo un certo numero di cicli non c’è più la doppia elica, quindi abbiamo un amplificazione lineare. I rapporti inizio:fine di amplificato non sarà 1:10⁶ ma 1:10⁵ al massimo. E’ molto frequente che o facciamo molte reazioni uguali o le facciamo più lunghe, questo per avere la stessa quantità di DNA finale. Per discriminare la sintesi di un solo filamento quello che si fa è aggiungere oligonucleotidi in maniera differenziale: almeno 50 volte di più quello che ci interessa, dell’altro solo un po’ per fare fare i primi (10) cicli, e avere un minimo di double-strand (1000 copie). E’ una PCR ottenuta attraverso un rapporto di oligo 50:1 o molto di più.

PCR & MUTAGENESI.
Non è detto che ci serva sempre una PCR fedele che riproduca i templati alla lettera, è possibile utilizzare la PCR nella mutagenesi in vitro. Introducendo così degli errori, che mi portino ad avere delle mutazioni.

RT-PCR (Reverse Translation PCR)
La trascrittasi inversa è molto utile ai fini della PCR, perché ci permette di partire da una miscela di messaggeri. Quando vogliamo fare lo studio di tutti i geni espressi in una cellula, possiamo estrarre tutti i messaggeri, a quel punto abbiamo l’RNA che si degrada troppo facilmente. Il sequenziamento su RNA è fallimentare, quindi la cosa più semplice dal punto di vista tecnico è quello di fare una copia su DNA che conserveremo in plasmidi.
Come adattiamo la PCR per ottenere la retrotrascrizione da messaggero a DNA?
Facciamo dei primi cicli in cui abbiamo i ss RNA, la trascrittasi inversa e i nucleotidi. L’enzima non è termostabile come la Taq o la Pfu, quindi non possiamo fare avvenire la reazione a così alta temperatura. Un altro limite dell’enzima è la sua incapacità di proof-reading, quindi può introdurre errori con una certa frequenza. Facciamo avvenire la reazione a 37-42 gradi, e otterremo ibridi RNA-DNA. Rimuovo l’rna con la RNAasiH, specifica per l’idrolisi di RNAds o di ibridi (a diff della RNAasiA che elimina solo il contaminante) torneremo a un ss di DNA, aggiungo una copia di oligo, quello che si appaia al 3’ del 1° filamento, avremo quindi un’oligo 5’-->3’ che viene allungato e che copia il risultato della prima reazione (ss --> ds). Ora aggiungo anche il secondo oligo, e avremo una normalissima amplificazione. (attenzione all’omologia egli oligo)
Insime ai dNtP introduciamo la TAQ, così facciamo cicli  da 92°, annealing a 60, allungamento a 70 come una normale PCR.
Come scegliere gli oligo?
Se conosciamo la sequenza del messaggero siamo a posto, scegliamo una zona con una Tmelting che ci va bene, scegliamo dove piazzarlo (lì vicini alle estremità, così anche se perdiamo 20 bp non importa: i trascritti non iniziano con l’AUG, ma vengono maturati nella cellula).
Il grosso problema è quando non conosciamo la sequenza del messaggero. e quindi non conosco i geni (organismo sconosciuto). Possibilità tecniche: se il 3’ è poliadenilato (eucarioti superiori), faccio una coda di poliT e riesco a copiare un’estremità (RACE). Ma l’altra? devo attaccargli delle code (terminal transferasi), ma la coda si attacca al DNA, non all’RNA. L’espediente tecnico è quello di copiare in modo più o meno esteso le estremità. Possiamo con sequenza molto piccole dividere in 2 il gene, copiare prima dal 5’ verso il centro, poi dal 3’ verso il centro, cerchiamo di ottenere 2 copie che si sovrappongono in mezzo, cloniamo tutti e due, taglia e cuci e mettiamo insieme i due pezzi. Le tecniche oggi sono ottimizzate e danno buone rese.