Fino ad ora abbiam parlato di geni più o meno wild-type, non abbiamo mai parlato di mutagenesi. I mutanti di cui abbiamo parlato erano ottenuti attraverso la genetica classica, che prevede di trattare con agenti mutageni una certa popolazione, selezionando per un certo fenotipo ed isolando quindi il gene. Si tratta quindi di una mutagenesi in vivo, ed è legata al tipo di cellule. In genere viene fatta su organismi semplici, che si riproducono in modo controllato e di cui si conosce bene la genetica, la biochimica ecc. (lievito, coli, drosophila).
Qui ci occuperemo di reverse genetic: partiremo dai geni e in vitro introdurremo delle mutazioni. una volta introdotta la mutazione riintroduciamo il gene nell’ospite, e andremo a valutare il fenotipo.
Quali sono le tecniche di mutagenesi in vitro?

Le tecniche possono essere tre+1:
1.Mutagenesi Random, casuale e casuale localizzata;
2.Mutagenesi che porta a ristrutturare e modificare segmenti di DNA tramite delezioni, inserzioni, linker scanning.
3.Mutagenesi sito specifica.
4.[Mutagenesi con PCR]

Tutte queste metodiche hanno uno schema generale, questo schema prevede:
Isolamento del gene che viene clonato in un vettore (plasmidico o fagico)
In vitro mutagenesi (in cui si sviluppanole varie differenze);
Introduzione dei plasmidi in Coli e selezione con Ampicillina;
A questo punto posso:
isolare i singoli trasformanti, e quindi analizzare i singoli plasmidi uno a uno;
oppure utilizzare tutti i plasmidi per costruire una genoteca di mutanti, per cui tutti i plasmidi vengono fatti crescere, ritrasformo ospiti opportuni per costruire la genoteca.
In entrambi i casi alla fine devo avere un saggio che mi permette l’individuazione della mutazione (saggi di funzionalità).
Una volta isolato il gene mutato viene introdotto nell’ospite originale e si va a vedere l’effetto (--> fenotipo).

La differenza iniziale fra mutagenesi random e mutagenesi sito-specifica è che in quella random non ho bisogno di grosse info a priori sul mio prodotto (il gene),
nel caso della mutazione sito-specifica invece io devo avere informazioni sulla funzione del gene, in modo tale che io possa scegliere in modo mirato il tipo di mutazione da introdurre.

Il primo tipo di mutagenesi, proprio com’è impostata, porta ad un grande n° di mutanti (è random…) quindi devo avere anche un sistema rapido di screening (non mi metterò mica a sequenziare tutti i mutanti che escono!…).
Nel caso della mutagenesi sito-specifica ho invece come risultato un ristretto n° di mutanti, e in alcuni casi anche uno solo, quindi non necessito di questo screening rapido, ma è meglio avere uno screening specifico.