I plasmidi sono introdotti in Coli come DNA nudo: metto a contatto cellule di Coli rese competenti con plasmidi ottenuti in vitro. Per fare diventare le cellule competenti ci sono una serie di protocolli sperimentali che prevedono l’utilizzo di ioni bivalenti (CaCl₂), altri metodi non di routine per Coli prevedono l’elettroporazione(utilizzo più ampio in eucarioti): brevi scariche elettriche favoriscono l’uptake del plasmide.
Una volta rese le cellule competenti il DNA può essere introdotto incubando le cellule con la soluzione di DNA plasmidico (il batterio ora è trasformato).
Per assicurarmi che le cellule siano trasformate, piastro terreni selettivi: ad esempio posso mettere una resistenza alla ampicillina nel plasmide e piastrare su un terreno con quell'antibiotico: solo le cellule trasformate sopravviveranno.
Una volta individuata una colonia che possiede il plasmide posso farla crescere su terreno liquido, per avere grandi quantità del plasmide (che devo studiare, sequenziare o usare..)
Altri vettori utilizzati per Coli sono i fagi. Posso introdurre sia DNA nudo che DNA ricostruito (all’interno della particella fagica).
P er l'introduzione di DNA nudo rendo le cellule competenti (come prima), ed utilizzo il fago come vettore. In questo caso farò cresciere una patina uniforme di batterio, sulla quale mettero i miei fagi (o distribuisco uniformemente sull'intera piastra una soluzione di batteri e fagi), al posto di colonie troverò delle placche dovute alla lisi causata dal ciclo litico del fago.
I vantaggi rispetto al plasimide sono fondamentalmente la possibilità di clonare frammenti di dimensione maggiore. Se con i plasmidi arrivavo a 15 kbp, con i fagi posso usare frammenti più grandi: permettono quindi uno screening su grandi numeri.
Di seguito osservazioni sul fago come vettore, non come organismo.

FAGO LAMBDA.
Permette il clonaggio di frammenti. fino a 20 kb.
Ha una testa icosaedrica, all’interno della quale c’è il DNA lineare impaccato, e una coda, i cui costituenti sono codificati dai geni del fago.
Schematicamente il DNA fagico (per un totale di 48500 bp) è così:

|–ORI–|– lisi –|–– lisogenia ––|–– proteine testa/coda ––|–– terminasi ––|

In più abbiamo la zona tra 20 e 38 kb e a livello di 42 ci sono i geni necessari per il processo lisogeno.
Le estremità sono estremità coesive, perché sono presenti i geni cos (12 bp). Durante il ciclo vitale il genoma lo possiamo trovare sotto diverse forme:
Esiste anche nella forma circolare. Durante l’infezione al batterio il DNA fagico viene introdotto dal virus come lineare. Per le estremita cos, il filamento di DNA si circolarizza, ed i nick rimanenti vengono chiusi da Coli. Questo rappresenta l’intermedio sia per la replicazione sia per l’integrazione. Quando si integra, l’integrazione avviene in punti specifici che avvengono a seconda del fago. Non avviene a livello del sito cos, ma in posizione sfalsata, quindi integrato il DNA è permutato rispetto a quello che troviamo nella testa (i geni sono quelli ma l’ordine è diverso).
Esiste anche sottoforma di concatenameri: unità ripetute nel genoma saldate a livello dei siti cos, questi si formano perché all’interno della cellula la forma circolare si replica secondo il modello “rolling-circle”: si forma un nick, la parte interna funge da stampo su cui viene sintetizzato il secondo strand. Man mano che viene sintetizzato si ha l’estrusione dello strand, man mano che il single strand viene estruso interviene l’RNA (che funge da primer e poi è eliminato) eccetera e si forma il secondo (–> concatameri).
Nella replicazione del virus, il concatenamero viene introdotto all’interno delle teste vuote. Una volta introdotto il pezzo che serve (fino all'estremità cos) interviene la terminasi (sintetizzata contemporaneamente) che riconosce, si lega e taglia a livello dei siti cos. Quello che entra è quindi DNA ds lineare. Una volta entrato il dna, il packaging virale si completa, attaccandosi anche la coda.
Esiste un vincolo di dimensioni per quanto riguarda l’impaccamento del DNA all’interno della testa: il genoma non deve essere più piccolo di 38 kb e non deve essere più grande di 52 kb. Le dimensioni medie sono 50.