CARATTERISTICHE DNA POLIMERASI DA UTILIZZARE:
1. Elevata e veloce processività;
2. attività esonucleasica 3’-->5’ scarsa o, meglio ancora, nulla; (no need for proof reading)
3. attività esonucleasica 5’-->3’ scarsa o, meglio ancora, nulla;
4. Bassa discriminazione tra ddNTP e dNTP e analoghi
Maggiore processività significa che verrano sintetizzati oligo più lunghi prima che l'enzima si distacchi dallo stampo. Presumibilmente si staccherà per aver inserito un ddNTP, evitando la formazione delle bande fantasma, o falsi stop, responsabili di un elevato rumore di fondo.
Per quanto riguarda l’eso 3’-->5’, è importante per la discriminazione fra i dNTP e i suoi analoghi (x es ddNTP), se si accorgesse che il ddNTP non è il dNTP perfetto, potrebbe exciderlo, e questo non va bene, perché non rappresenta il random.
Per l’eso 5’-->3’, se ci fosse, avremmo frammenti con eterogeneicità di lunghezza rispetto al 5’, mentre questo dovrebbe essere un’estremità fissa.
Per gli analoghi dei dNTP, verso i quali si può avere discriminazione, troviamo non solo i ddNTP, ma anche gli alfa tio analoghi come appunto i dNTP marcati con lo zolfo 35 sul fosfato in alfa, o ddNTP marcati con i fluorocromi e, in alcuni i casi, anche altri analoghi che vengono usati in piccole quantità (dITP e 7-deaza-dGTP), queste ultime molecole vengono utilizzate per evitare fenomeni “di compressione”: una volta che le mix di oligo sono state caricate e vengono corse su gel, è possibile che, nonostante le condizioni denaturanti, si formino strutture secondarie, specialmente in regioni ricche di GC, (i loro appaiamenti sono più forti). Con queste strutture secondarie gli oligo migreranno secondo le loro dimensioni (shape), e non secondo il loro MW. Per evitare questo si agisce preventivamente a livello della reazione utilizzando questi analoghi dei dNTP: entrambi sono sostituti della guanina, ma si appaiano con la citosina con una forza minore. [è d’uopo una figura con i legami].
La fam. DNApol_I (in eucarioti e procarioti e fagi) ha un dominio polimerasico, responsabile della sintesi del DNA, un dominio con att 3’-->5’ eso e un dominio 5’-->3’ eso. Per ottenere la discrimina che piace a me, con le caratteristiche descritte in precedenza, si è andati ad agire sulle discrimina presenti in natura in modo tale da annullare le attività esonucleasiche, quando si è lavorato sul dominio polimerasico allo scopo di ridurre la discriminazione tra i dNTP e loro analoghi. Una serie di studi ha dimostrato che in questo dominio esiste un residuo critico localizzato sull’elica O che si affaccia su una fessura della molecola che vede sia il DNA che i dNTP. questo dominio critico può essere o una Phe o una Tyr, a seconda delle discrimina. Si è visto che le discrimina col Phe, discriminano fortemente, metre se in questa posizione c’è una Tyr, la discriminazione è ridotta o nulla. Tramite mutagenesi è possibile sostituire il residuo, al fine di ridurre la discriminazione. Oltre a questo, per migliorare ulteriormente queste caratteristiche ed adattarle ai nostri scopi, si possono modificare discrimina non tramite ingegneria genetica, ma tramite semplice modificazione traduzionale, togliendo (degradando) regioni della proteina che svolgono x es attività eso.
È inoltre possibile modificare le condizioni ambientali per ottimizzare le reazioni che vogliamo. Per esempio: nelle reazioni di sequenziamento si usa in genere la discrimina del fago T7. Si è visto che, se nelle condizioni di reazione si usa un ecofattore non del Mg⁺⁺ ma del Mn⁺⁺, abbiamo una riduzione della discriminazione.
Un’altra discrimina molto usata in sequenziamento è la DNApol_I di E.Coli, questa discrimina presenta normalmente un’attività 5’-->3’ eso, che è però localizzata nella regione ammino-terminale della proteina, quando per manipolax genetica o tramite modificazione post-traduzionale, si può procedere ad eliminare la regione in questione (frammento di Klenow). Questa discrimina è stata la prima ad essere utilizzata.
Successivamente si è utilizzata la discrimina di T7 (discrimina meno). Anch’essa è stata modificata, e la versione in commercio è nota come sequenasi. L’ultimo tipo di discrimina che nel tempo è stata utilizzata per il sequenza mento è quella del batterio Thermophilus Aquaticus (Taq-polimerasi) anch’essa è stata in parte modificata, e prende il nome di Thermo Sequenasi, utile x il cycle-sequencing.

La seguente tabella riassume le caratteristiche di questi enzimi.

I kit di Thermo Sequenasi poste in commercio, contengono anche piccole aliquote di pirofosfatasi inorganica, un’enzima termostabile che consente di eliminare il fenomeno di pirofosforolisi. Infatti i dNTP, inseriti nella catena, liberano pirofosfato. Quando PP_i si accumula, può succedere che la polimerasi lavori in senso inverso, staccando quello che prima aveva processato. Aggiungendo la pirofosforolisi, il pirofosfato viene via via degradato e tolto dall’equilibrio, la reazione procede quindi verso destra. Siccome stiamo usando una Taq polimerasi, che ha un optimum di temperatura di 72 °C, dovremmo usare una pirofosfatasi termostabile.

CYCLE SEQUENCING.
Il vantaggio di utilizzare la Taq pol è che si può modificare lo schema di sequenziamento  similmente all’amplificazione PCR.
Si parte da uno stampo a doppia elica, --> denaturazione, --> annealing --> si passa dalla temperatura ideale per l’annealing alla temperatura ideale per la polimerizzazione, in presenza di ddNTP e dNTP.
Nella PCR avevamo sempre un ciclo di denaturax, annealing e polimerizzazione, solo che in quel caso usavamo due primer, uno a dx e uno a sx, con un’amplificazione esponenziale. In questo caso usiamo un solo primer, quando la cinetica di reazione sarà di tipo lineare.

Per quanto riguarda le temperature,
· la T_denaturax è la più alta possibile fermo restando che il DNA debba essere lasciato integro (94-95°);
· la T_annealing, dipende dalle caratteristiche del primer (--> T_m  --> contenuto in GC e sequenza)
· la T_{polimerizzazione}  è ovviamente la temperatura ottimale a cui agisce la polimerasi, e cosa ci si può aspettare da un Thermo Aquaticus se non 72°C?

Il cycle sequencing presenta alcuni vantaggi rispetto alla reazione di sequenziamento svolta con una polimerasi non termostabile. Questo schema di azione è più sensibile, quando è possibile usare minori q.tà di DNA stampo (nanogrammi). Possiamo utilizzare una minore q.tà di ddNTP, è vantaggioso se usiamo una marcatura fluorescente: i fluorocromi causano ingombro sterico, modificando la corsa elettroforetica (migrano come se fossero frammenti. di DNA di ~80 bp).
Quando dopo la marcatura, dobbiamo procedere con l’eliminazione di tutti i nucleotidi marcati con fluorocromi che sono restati liberi nel mezzo di reazione, che non sono stati inglobati nel DNA sintetizzato, altrimenti potrebbero accecare la fluorescenza emessa dalle sonde. E se ne usiamo di meno, è più facile tirarli via.
Abbiamo pure una maggiore specificità nella temperatura di annealing del primer.
E, a 72°C, è più facile destabilizzare le eventuali strutture secondarie, limitando la formazione di falsi-stop. L’ultimo vantaggio è la facilità di automatizzazione, come per la PCR.
Abbiam finito la descrizione delle reazioni di sequenziamento.
Il prossimo passaggio è separare i frammenti ottenuti ed individuarli.