Marcature
Radioattiva:
- a livello dei dideossinucleotidi: [α – ³⁵S], [α – ³³P], [α – ³²P] dATP
- a livello del primer (marcato al 5’): [γ – ³⁵S], [γ – ³²P] dATP
Il fosforo 32 è un forte emettitore, quindi possiamo usare tempi brevi. Tuttavia potrebbe essere che bande molto marcate coprano bande più piccole. Si è quindi passati ad usare lo Zolfo 35, che emette sempre radiazioni beta ma ha energia nettamente inferiore rispetto a ³²P, quindi dovremo usare tempi di esposizione radiografica un po’ più lunghi, ma otterremo bande più risolute. (inoltre un forte emettitore potrebbe anche rompere casualmente legami fosfodiesterici, causando false bande). Meglio di tutti è il fosforo 33, che emette delle radiazioni beta ma ad energia intermedia fra ³²P e ³⁵S, questo ottimizza la reazione: buona qualità e buoni tempi.
³⁵S viene inserito al posto dell’Ossigeno sul primo fosfato in α del nucleotide (di solito si utilizza ³⁵S per marcare il deossinucleotide, non il dideossi) il fosfato in alfa è quello immediatamente legato al desossiribosio.

Fluorescente:
- a livello dei ddNTP;
- a livello dei dNTP;
- a livello dell’oligo (estremità 3’);
- a livello del primer (estremità 5’).
La fluorescenza consiste nella capacità di alcune sostanze di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa λ₁ e di emettere una frazione dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d’onda differente e superiore a quella assorbita. Le molecole che sono in grado di dare fluorescenza, usate per questo tipo di marcatura vengono comunemente chiamate fluorocromi. Per adoperare questo marcatura abbiamo bisogno di una fonte di radiazione EB ad una precisa λ (in genere si usa un laser) che emette radiazione E/B a λ₁, che è la λ di assorbimento del fluorocromo. Dovremo avere un sistema di rilevazione che ci consenta di misurare la quantità di radiazione E/B λ₂ emessa. Il fluorocromo può essere legato al primer (5’), ai deossi, o in alternativa a dideossi nucleotidi.
I fluorocromi, per essere tali devono essere:
- Stabili
- Presentare elevata intensità di fluorescenza (efficienza quantica)
- nel caso in cui si utilizzino fluorocromi multipli (2 o 4 --> ATCG), è necessario che assorbano tutti a λ₁ (1 solo laser) e che riemettano radiazione E/B a differenti e distinguibili λ₂ (gli spettri di emissione devono presentare sovrapposizione minima)
I fluorocromi sono molecole generalmente grandi, che danno quindi luogo a fenomeni di ingombro sterico, quindi quando un’oligo viene marcato diventa più grande --> la mobilità elettroforetica sarà diversa e, di fatto più piccola.
Anche in questo caso, se usiamo più fluorocromi assieme, è auspicabile che influenzino in maniera uniforme la mobilità elettroforetica dei nucleotidi a cui sono legati.

La marcatura fluorescente può essere singola o multipla.
Con la marcatura fluorescente singola (One dye system) si usa lo stesso fluorocromo su diversi dNTP per i diversi sotocampioni (similmente alla radioattività), quindi a livello di corsa elettroforetica devo caricare ogni singolo sottocampione su una linea diversa del gel.
Con la marcatura multipla (Four dye system) usiamo 4 diversi fluorocromi che marcano i 4 dNTP. Il vantaggio è che posso compiere le 4 reazione in una stessa miscela, e i 4 tipi di sottocampione saranno riconosciuti in base alle 4 diverse emissioni. Possiamo quindi usare lo stesso tubo (elettroforesi capillare su PAGE denaturante). In questo caso, potremmo avere problemi per quanto riguarda la mobilità elettroforetica, quindi per l’interpretazione dei dati dovremo utilizzare un algoritmo più complesso di quello che si usa nel caso della marcatura con una singola molecola fluorescente.

Algoritmi di base-coding
I dati raccolti dal rilevatore devono passare attraverso un algoritmo per poter essere trasformati in qualcosa di leggibile. Si utilizzano un computer e dei programmi con degli algoritmi di rilevazione ben precisi. I dati saranno costituiti da una serie di picchi di fluorescenza parzialmente sovrapposti l’uno all’altro. Ciascun picco corrisponde ad un segnale che viene emesso da un singolo frammento (oligo) di DNA. L’algoritmo di base-coding (rivelazione) è un algoritmo di processamento del segnale che consente di identificare con precisione i picchi, separarli, eventualmente shiftarli (soprattutto nel caso in cui abbiamo utilizzato 4 diversi fluorocromi) e in ultimo attribuire direttamente la basi.
Se nel caso della marcatura radioattiva noi avevamo una lastra che dovevamo leggere manualmente, in questo caso abbiamo direttamente, su file, pronta per essere confrontata con le banche dati, la nostra sequenza. Questa automatizzazione del metodo rappresenta un vantaggio doppio, perché riduce i tempi e la probabilità di errore umano.
Tra gli altri vantaggi della fluorescenza è che, rispetto alla radioattività, non è pericolosa per l’uomo.