GENE-CHIP

C’è un chip già fatto dove c’è un supporto di silicio, dimensioni: 1.28 cm2 suddiviso in piccole aree. Ogni area contiene generalmente 107 oligo uguali di lunghezza 18-20 basi. 20 aree rappresentano un gene, quindi ogni gene è rappresentato da 20 oligo diversi scelti accuratamente. Nel caso di genomi sequenziati completamente ci sono chip che rappresentano tutto il genoma, nel caso di organismi con genomi ancora incompleti ci sono chip che rappresentano set di geni. Intorno alle 20 aree che rappresentano il gene ci sono dei controlli, come sempre.
Ci sono 20 aree, una rappresenta il gene wild-type, le altre hanno una singola mutazione centrale (MisMatch).
Alla fine il Gene Chip non è nient’altro che un’ibridazione automatizzata, abbiamo una sonda a RNA (attività specifica più alta), la macchina fa annilare la sonda e un sistema di rilevamento (fluorescente) ci dà i dati.
Il punto di partenza è l’RNA estratto da cellule, posso usare sia l’RNA totale oppure l’RNA messaggero (lo isolo dal totale facendo passare il totale in una colonna di poliT, sfrutto cioè la poliadenilazione). Uso sia un estratto da cellule normali che un estratto di cellule seviziate, poi ne valuto la differenza. Ho l’RNA, faccio il cDNA, quindi trascrittasi inversa e primer (oligodT), però all’oligo c’è attaccata, come ala, una sequenza che corrisponde al promotore della T7 RNApol (cominciate a pensare a cosa possa servire). Ho la synth e ottengo un ibrido RNA/DNA. aggiungo RNAasi A, che mi frammenta l’RNA, questi possono essere usati dalla T4pol per iniziare il 2° strand, e ottengo il dsDNA.
Con il double strand, con il promotore della T7, aggiungo pure la T7 RNApol, aggiungo pure i nucleotidi e sintetizzo l’RNA. L’RNA che ottengo è complementare all’RNA di partenza (pensare a dove è stato messo il promotore).
Questa operazione è necessaria perché sui chip ci sono gli oligo senso!
Ovviamente devo marcare il mio RNA, aggiungendo biotina alla sintesi in vitro, (l’RNA sarà tutto marcato).
Ho la mia sonda marcata e in genere viene frammentata in modo specifico ottenendo una mix di frammenti*. Quindi ho tutti gli RNA iniziali rappresentati da miscele di antiRNA*. In questo modo ho una sonda con alta attività specifica (amplificazione del segnale) che mi serve dato che i volumi sono ridotti.
Con una siringa metto la sonda sul chip e inserisco questo nella macchina che fa gli appaiamenti e i vari lavaggi automatizzati. Tuttavia siccome queste analisi devono essere fatte in modo comparato e queste molte volte significa che quello che faccio io, a Milano deve essere confrontato con quello che fai tu a Zurigo, non è che ognuno può variare le condizioni di ibridazione o le condizioni di preparazione dell’RNA o le condizioni di estrazione. L’ESPERIMENTO deve essere RIPRODUCIBILE, quindi bisogna STANDARDIZZARE il tutto.
Siccome la biotina deve essere rilevata, in questi passaggi c’è la streptavidina (cfr. Metodologie Biochimiche) che, durante l’ibridazione, si lega alla biotina. Alla Streptavidina è legato un fluorocromo, quindi col laser e un CCD vado direttamente sul computer del mio ufficio. La q.tà di fluorescenza è proporzionale alla q.tà di sonda legata e quindi di messaggero e quindi le variax che io vedo riflettono quelle che ho nelle cellule.
Dal PC escono una marea di numeri, e il bioinformatico che ho assunto, mi fa un bel lavoretto con i suoi database fa dei programmini che dicono sotto e sopra quale soglia (avevamo un controllo/bianco iniziale) la variazione è significativa.
Non mi resta che scrivere un bell’articoletto e spedirlo a Science.
Sicché i dati sono tanti, sono stati sviluppati software che permettono via via un’analisi in cluster: raggruppo tutti insieme quelli che aumentano di 3 volte, raggruppo quelli che diminuiscono di n, e così via. Ovviamente, il fatto di aumentare/diminuire dipende dal promotore, quindi all’interno di questi cluster io vado a vedere se questi geni hanno promotori regolati in modo analogo, facendo analisi su promotori con tecniche che abbiamo già imparato.
? Ovviamente, quando uno fa indagini a tappeto, esiste anche una cosa che si chiama significatività di campionatura: se con la libreria sottrattiva bastava che la facessimo una volta, il GeneChip, va fatto più volte (e i chip non sono riutilizzabili), per avere almeno un’analogia di comportamento dei dati.
E questa è un tipo di genomica funzionale.