Classe di enzimi utilizzata in varie metodiche di biologia molecolare:
1. PCR;
2. Sequenziamento;
3. RNA > cDNA;
4. Mutagenesi;
5. Sintesi di sonde marcate
Tutte le polimerasi polimerizzano in direzione 5’>3’, ma con alcune differenze, la cui comprensione è fondamentale per la scelta in funzione del tipo di esperimento.
Devo tenere in considerazione:
- Processività
- Cinecità
- Affinità
- Range di temperatura
Il templato idoneo per le polimerasi è DNA a singolo filamento con un primer annilato (appaiato) che esponga un 3’-OH. Tutte necessitano del cofattore Mg⁺⁺ che stabilizza le cariche negative degli acidi nucleici. Il pH optimum è quello fisiologico, eccetto che per la T4 fagica.

DNA pol I di E.coli
Enzima intero (Oloenzima).
L’attività 5’ >3’ esonucleasica, a differenza di quella 3’ >5’ eso non è in competizione con l’attività polimerasica. Se non è bilanciabile significa che, a caso, l’enzima allunga da una parte e depolimerizza dall’altra.
A che serve allora?
- Nick Translation:  si parte da dsDNA lo si niccka e di forniscono precursori radioattivi (α-³²P-dNTP).  L’enzima smangia l’elica che trova davanti (5’ >3’ eso) e ricostruisce l’elica al suo passaggio (5’ >3’ pol). L’efficienza che è un bilancio tra smangio/attacco arriva al 70%.
- Gap filling:  Serve per bluntare estremità 5’-protruding in entrambi i sensi, dato che polimerizza attaccando nucletidi al 3’-OH sull’elica più corta usando la 5’-protruding come templato. Per regolare la cinetica si gioca sulla concentrazione di substrato fornito.
Se digerisco con pepsina ottengo il grosso frammento di Klenow dotato di due attività in competizione l’una con l’altra:
1. polimerizzazione 5’>3’;
2. esonucleasi 3’>5’;
È l’ambiente intorno alla polimerasi che decide quale attività deve svolgere.
Questa polimerasi è poco processiva: si stacca dopo circa 30 nucletidi, non va bene quindi per la PCR, ma ha una buona fedeltà dovuta all’attività di proof-reading esonucleasica.
Posso usare la DNApol I per riempire le estremità del 5’-protruding. E se facendolo fornisco dNTP marcati (³²P in α) posso fare una sonda.

T4 DNApol
È simile alla Klenow, ma a livello cinetico l’attività esonucleasica è più efficiente, è utile quindi per bluntare estremità 3’-protruding.