Gli enzimi di restrizione subiscono una grossa classificazione in eso/endo nucleasi:
Esonuclesi partono dall’estremità della catena polinucleotidica, possiamo avere diverse nucleasi a seconda che attacchino 3’ o 5’.
Endonucleasi tagliano solo all’interno della catena.
Un’ulteriore suddivisione è in base al tipo di taglio tra 3’ o 5’: alcune lasciano il fosfato al 5’ lasciando libero il 3–OH, altre viceversa.
Senza questi enzimi NON esiste il DNA ricombinante e tutte le tecnologie derivanti.

ENDONUCLEASI.

Sono chiamati enzimi di restrizione (RE).
Sono stati scoperti infettando Coli con batteriofagi: recuperando i fagi da un ciclo litico e usandoli per infettare un altro ceppo di Coli si vedeva che l’efficienza di recupero era molto bassa (“restrizione” dell’infezione), se venivano usati per infettare lo stesso ceppo l’efficienza era pressoché del 100%.
Questo era dovuto al fatto che ogni ceppo di Coli è in grado di proteggersi dall’entrata di DNA esterno, utilizzando da una parte enzima di restrizione, e dall’altra metilando il suo DNA (associate all’enzima di restrizione ci sono le sue metilasi, a volte sono 2 enzimi associati, in altri uno stesso enzima presenta due attività correlate). Quando entra DNA estraneo, non metilato, ci sono nucleasi che riconoscono sequenze specifiche e lo tagliano, successivamente intervengono nucleasi aspecifiche che idrolizzano completamente il DNA. Se un DNA fagico non fosse tagliato, verebbe metilato e nelle successive infezioni dello stesso ceppo sarebbe protetto (100%), ma non per enzimi di restrizione di altri ceppi. Sono stati isolati numerosi enzimi di restrizione (I II e III ) e metilasi (associate e no).

•  Enzimi di tipo I e III.
Gli enzimi di restrizione di tipo I e III sono in grado di legare sequenze specifiche, tagliare il legame fosfodiesterico lasciando sempre il fosfato legato al 5’, però tagliano lontano dal sito di rionoscimento, con distanze che variano dal tipo I al tipo III, inoltre hanno sempre associata l’attività metilasica sullo stesso enzima. Il fatto che taglino lontano dal sito di riconoscimento rende il sistema non controllato, quindi non sono utilizzati in vitro.

•   Enzimi di tipo II
Tagliano solamente all’interno del sito di riconoscimento, con modalità diverse.
Tutte riconoscono una sequenza palindromica (che presenta un asse di simmetria binario: se letti da sinistra o da destra hanno stessa sequenza). Il n° di basi conosciute può variare, in genere 4, 6, 8 o anche di più. Prima di tagliare l’enzima deve riconoscere la sequenza e legarsi, per esempio EcoRI riconosce 5’–GAATTC–3’, per legarsi ha bisogno di più basi (6 non bastano) deve quindi trovare delle zone a destra e a sinistra più ampie (con qualsiasi sequenza).
Ruolo dell’intorno:
1) decide quale elica viene tagliata per prima;
2) decide la velocità di taglio (sfruttata x digestioni parziali);

Una volta che si lega il taglio è sfalsato, cioè non avviene contemporaneamente sulle due eliche, ma prima su una e poi sull’altra (come in tutti i II).
La velocità con cui taglia è influenzata dal contesto di basi intorno (tutti i II): non sempre ci interessa fare digestioni totali (frammento di DNA, 5 siti Eco, condizioni ottimali, tutti i siti vengono tagliati).

A volte siamo interessa a digestioni parziali, perché?
1)  Per costruire delle banche. Se io ho estratto il DNA genomico non so nulla sul gene che vado a cercare, se quanto è lungo e su quanti siti ha. se faccio digestioni totali, ho un’altissima probabilità di spezzare il mio gene, e dopo non me ne faccio nienete. Siccome Eco non taglia su tutti i siti alla stessa velocità, posso fare in modo che, con condizioni sperimentali adeguate, tagli solo 2 siti su 3. A certe condizioni (standardizzate) sono sempre costanti i tagli effettuati.
Sono in grado poi di riconoscere (attraverso elettroforesi) digestioni totali da digestioni parziali.
2)  Può essere che su un gene di cui conosco già la mappa e che voglio clonare, non ci siano siti ottimali per il clonaggio, ammettiamo che questo gene l’ho isolato con Eco, ma quando faccio la mappa di restrizione noto che ho dentro un altro sito Eco: per clonarlo in un nuovo plasmide posso solamente usare Eco. È ovvio che, se faccio una digestione totale con Eco il mio gene si rompe, allora faccio digestioni parziali sperando che tagli nel posto giusto (effettuando diverse prove in diverse condizioni di taglio).

Una cosa da ricordare (anche per la PCR) è che il sito di legame è sempre più lungo del sito di riconoscimento. Questo è importante:
1) Quando uno deve costruire degli oligo con le ali, dove le ali rappresentano un sito di restrizione utile al clonaggio successivo. Se metto nel sito solo le 6 basi non riuscirò mai a clonare, perché il povero EcoRI quando si trova il frammento non è in grado di legarsi. Ci sono tabelle che indicano per ogni enzima quante basi ne servono. Prima di clonare aggiungo l’enzima che taglierà qui e qui, avrò le estremità che mi servono e potrò clonarlo. È importante quindi tener conto delle estremità adiacenti.
2) Nel clonaggio in siti molto vicini (nei plasmidi c’è il sito di inserzione multipla: siti di restrizione unici uno di seguito all’altro. A distanze che vanno da 1 a 50 bp ho N siti di restrizione) se vado a scegliere due vicini devo stare attento all’efficienza di taglio: una volta che ho tagliato il plasmide col primo (il plasmide sarà aperto) e decido che voglio tagliare lì vicino ma ci sono poche basi o non taglia o l’efficienza di taglio diminuirà, avrò quindi difficoltà a clonare e ad ottenere quello che mi interessa.

Posso classificare gli enzimi di restrizione in base alle estremità che generano:
· 5’ protruding (EcoRI)
· 3’ protruding
· blunt.

ISOCAUDAMERI:  Esistono enzimi che riconoscono siti diversi ma lasciano estremità compatibili (BamHI e Sau3A) questo è importante per il clonaggio: quello che mi interessa è l’estremità non lo stesso sito di restrizione (ho più possibilità in pratica).
Non necessariamente quando si uniscono i due frammenti si riforma o il sito Bam o il sito Sau!

ISOSCHIZOMERI:  Esistono enzimi, isolati da organismi diversi e quindi con nomi diversi e talvolta con esigenze diverse, che riconoscono lo stesso sito come SmaI e XmaI.
Il riconoscimento uguale non implica caratteristiche uguali: in alcuni casi il taglio è differente.
Oggi sono più di 2000 gli RE individuati (Ci sono servizi di aggiornamento mensili via mail con REBASE).

Endonucleasi prive di sequenza di riconoscimento.

Ci sono altre nucleasi che non riconoscono sequenze specifiche, ma sono capaci di tagliare in modo specifico un filamento DNA (DNAasi) o di RNA (RNAasi).

DNAasi I
Isolata dal pancreas taglia DNA sia ssDNA che dsDNA, preferenzialmente in siti adiacenti a pirimidine (T, C). I prodotti sono miscele complesse di mono e oligo 5’-P.
Ha due modalità di taglio che dipendono dalla presenza di ioni bivalenti:
- Mg⁺⁺:  attacca indipendentemente entrambi i filamenti di DNA e i siti di taglio sono distribuiti in un modo statisticamente casuale.
- Mn⁺⁺: taglia entrambi i filamenti approssimativamente nello stesso sito, formando frammenti di DNA con estremità blunt o che protrudono di solo 2 o 3 nucleotidi. In condizioni controllate posso fare in modo che produca solo dei nick.

Che mi serve una DNAasi I?
1. RT PCR. Prevede come templato dell’RNA, che è estratto da cellule. Ogni estrazione non mi dà il 100% di RNA, ci sarà qualche contaminazione di DNA. Quindi prima faccio un passaggio purificatorio con DNAasi.
2. FootPrinting. Intuitivamente, se ho del DNA a cui è legata una proteina, questo dovrebbe proteggere il DNA dal taglio della DNAasi, quindi avrò una miscela che, trattata con DNAasi mi darà più o meno digestione, lasciando un’ “orma” (footprint) su un elettroforesi della miscela di cleavage.
3. Nick Translation. E' una reazione rapida ed efficiente per marcare uniformemente DNA a doppio filamento. La reazione si basa sull'attività sequenziale di due enzimi sulla molecola di DNA. La reazione ricalca quanto avviene in vivo per la riparazione dei danni del DNA batterico dovuto ai raggi UV. In una prima fase l'endonucleasi DNasi I produce su entrambi i filamenti un nick, cioè una rottura del legame 5'P - 3'OH tra due basi adiacenti. A questo punto si aggiunge la DNA polimerasi I con i 4 deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) in un'opportuna miscela di reazione. La DNA polimerasi I si lega all'estremità 3' prodotta dall'attività endonucleotidica della DNasi I. Tale estremità funge da innesco per l'attività dell'enzima DNA polimerasi I che è caratterizzato da un attività esonucleotidica 5' -> 3' che elimina le basi non marcate che incontra sostituendole, grazie alla sua attività polimerasica, con le basi marcate presenti nella miscela di reazione. Il risultato finale della reazione sarà una molecola a doppia elica marcata in un alta percentuale dei suoi nucleotidi.

RNasi (endoribonucleasi).
- RNasi A. Isolata dal pancreas, attacca ssRNA in 3’ di un residuo di pirimidina tagliando il legame fosfato al nucleotide adiacente. Lascia 3’-P e 5’-OH. Lavora senza necessità di cofattori o di ioni bivalenti ed è sensibile ad alcuni inibitori.
- RNasi T1. Isolata da Aspergillus, attacca il 3’-P  delle Guanine e taglia il legame fosfato con il nucleotide adiacente rilasciando oligonucleotidi col terminale  guanosina-3’-fosfato (5’~~~G-3’-P)

Di solito si usa la RNasi A, e la si usa quando voglio eliminare l’RNA dalle mie preparazioni di DNA. O per rimuovere regioni di RNA non ibridizzate con DNA.
In genere però qualsiasi purificazione di RNAasi lascia q.che DNAasi come inquinante. Poiché DNAasi è sensibile al calore rispetto a RNAasi quello che faccio è scaldare la mia soluzione prima di usare l’enzima RNasi.
L’unico modo di inattivare le RNAasi è utilizzare inibitori specifici, utilizzati per estrarre in modo specifico l’RNA: poichè sono diffuse (anche sulle mani), devo prendere tutte le precauzioni quando voglio estrarre il mio RNA. Utilizzare i guanti, per la sua estrazione.

Esonucleasi

Tagliano il DNA dall’esterno verso l’interno, attaccandosi ad un terminale più o meno specifico e smangiando verso l’interno. Vedremo Bal31 ed EsoIII.

BAL 31
Deriva da Alteromonas espejiana. Digerisce il dsDNA in modo sequenziale da entrambe le estremità, richiedendo Calcio come cofattore. Attacca dal 3’-OH, smangiando, e questa è la prima veloce reazione a cui segue una seconda più lenta che dà origine a blunt ends nel 10-20% dei casi e a protruding di circa 5 nt nel 80-90% dei casi. La velocità dipende anche dalla composizione in basi: con AT è più veloce.
Le eso non possono intaccare DNA circolare. Se aggiungo un chelante (EGTA EDTA) posso fermare la reazione.

A che mi serve?
1. Ho il DNA, aggiungo l’enzima, a vari tempi prelevo un’aliquota a cui aggiungo il chelante, avrò i vari tempi della digestione ottenendo frammenti inizialmente più grossi e via via più piccoli dello stesso gene. nalizzando su gel avrò bande che cresceranno in numero e diminuiranno di intensità. Questo è un sistema che mi permette di determinare l’ordine dei siti di restrizione. Non sempre (a meno che non sequenzi) io riesco in base a tutte le digestioni che faccio a disporre in modo univoco i vari siti. Questo sistema me lo permette invece.
2. Tutte le volte che voglio creare delle delezioni, posso partire da un gene lungo 30Kb, ma man mano posso cercare di ridurre le dimensioni per studiarlo in modo più fine.
3. Ho isolato il promotore di un gene, costruisco pezzetti sempre più piccoli che metto in 5’ ad un gene reporter e vedo se posso avere trascrizione, se la trascrizione aumenta/diminuisce ecc…
4. Per costruirmi cloni deleti per sequenziare: il sequenziamento ha dei limiti di lunghezza, a seconda della polimerasi. in questo modo riesco a frammentare il DNA con frammentazioni facilmente sequenziabili.
5. Mutagenesi Random

Limiti di questo sistema:
- La mix finale è composta per la maggior parte da questo? se voglio clonare i vari frammenti di restrizione, li metto su gel ma non ho molta differenza di dimensione,  quindi devo modificare l’estremità usando un altro enzima.
- Inoltre l’idrolisi avviene sia in un senso che nell’altro. Non sempre mi interessa. Posso essere interessato ad un maggior controllo dell’idrolisi (che inizi a smangiare da una sola estremità).

Esonucleasi III.
Isolato da Coli. Eso III ha attività diversa a seconda del tipo di estremità: agisce sulle estremità blunt o 5’ protruding ma non sulle 3’. La reazione parte sempre dal 3 OH, ma se c’è un 3’ protruding l’enzima non smangia. Anche questa reazione necessita di ioni bivalenti, quindi con un chelante posso fermare la reazione e monitorare.
A diff. di quello visto prima, se io ho il DNA circolare, taglio prima con un’enzima che mi lascia estremità blunt o 5’ (Eco taglia 5’), se lo aggiungo adesso smangia di qua e di là. In genere i frammenti vengono clonati in polilinker (siti di clonaggio multiplo), per cui, dopo aver tagliato con enzimi che hanno estremità 5’ taglio con un enzima che dà estremità 3’, quindi avrò un un filamento che di qua è 3’ e di là è 5’.
Ovviamente il 2° enzima taglia dalla parte del DNA dove voglio che agisca, proteggendomi un’estremità dall’azione di Eso III. In questo modo posso anche smangiare solo un promotore lasciando stare il gene.

Nucleasi S1
Dopo le varie modifiche posso chiudere il plasmide ottenendo un mix di plasmidi via via più piccoli che hanno dentro delezioni.
Il fatto è che con le estremità che lascia non si può clonare: a diff. dell’altra non ho neanche niente di blunt. Cosa faccio? Uso un enzima che si chiama S1 nucleasi, che agisce in modo specifico sul DNA single strand eliminandolo.
Quindi aggiungo S1nucleasi e questa elimina l’estremità che protrudeva e si ferma lasciando tutto blunt.
L’unico svantaggio: S1 agisce in presenza di Zn⁺⁺ a pH acido (4.5). Il pH acido a livello di DNA e RNA causa la depurinizzazione delle purine! McBIN agisce a pH basico come S1, che è meglio.