T7 DNApol
Prevale la processività (fino a 400 nucletidi), la variante ‘Sequenasi’ è usata nel sequenziamento.

Costruzione di sonde
Parto da dsDNA digerito con una esonucleasi in modo tale da ottenere due ssDNA uniti da un piccolo joint di dsDNA. Aggiungo T7pol + dNTP*, otterrò due catene marcate speculari su filamenti opposti.

------------   eso             ---------  T7   *******------
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Tagliando separando i due filamenti (denaturando o con enzimi di restrizione), otteniamo due sonde in grado di attaccarsi una al filamento senso del DNA, l’altra al filamento complementare. L’utilità è che in questo modo possiamo sapere quale elica del gene viene trascritta usando queste sonde per ibridizzare l’mRNA.

Trascrittasi Inversa
È una DNA polimerasi RNA dipendente, nel senso che usa come templato filamenti di RNA con opportuno primer annealato.
Riesco ad ottenere un ss cDNA appaiato a RNA che degrado con RNasi H.
Ora o fornisco un secondo primer o è lo stesso cDNA che si piega (loop)e fa da primer per se stesso. Ottengo alla fine ds cDNA.

Terminal Transferasi
Attacca code di nucleotidi (anche blunt) senza necessità di templato. Se non c’è Mg⁺⁺ si accontenta di Mn⁺⁺.
Utile per il clonaggio di frammenti blunt di cui non si conosce la sequenza: gli fornisco un solo dNTP (dTTP), poi separo i filamenti allungati con il singolo dNTP fornito (divido --------- da --------TTTT) e uso quest’ultimo per il clonaggio in un inserto con poly(A) protruding: metto insieme un plasmide tagliato in una sequenza di poly(A), e il mio filamento-poly(T); questi si appiano, con polimerasi riempo le basi mancanti, e con ligasi chiudo i nick: ho incluso (clonato), nel plasmide il mio frammento.

DNA polimerasi per la PCR.
Sono termostabili, quindi permettono di allestire cicli di reazione: Cicliamo da 94° , in cui abbiamo denaturazione DNA, a Temperatura ottimale per l’attività enzimatica. Non dobbiamo ad ogni ciclo aggiungo l’enzima (come veniva fatto prima di isolare queste particolari DNA polimerasi).
La capostipite è la TAQ (proveniente dal cappo Thermus aquaticus), che subisce l’inattivazione da caldo ma non la denaturazione: se si raffredda la temperatura è ancora attiva. È in grado di polimerizzare fino a 70 °C ed è stabile fino a 95 °C. Si tratta di una polimerasi veloce e meno accurata della PFU, è quindi preferita in diagnostica e in analitica.
La PFU (Pirococcus Furiosus) è più accurata (ha proof reading che assicura il controllo della polimerazione) anche se meno veloce, utile quindi nella PCR preparativa.