Sono stati messi a punto dei sistemi di selezione che favoriscono la selezione dei ceppi dei cloni mutati:

Doppio Primer
Ho sempre il mio ssDNA che contiene il mio gene clonato, questo plasmide di partenza ha però 3 geni di selezione per Coli, quello con la Tetraciclina, che è funzionante, e quello dell’Amp che presenta una mutazione. Quindi il plasmide di partenza, se usato così, lascia E.Coli AmpS. Da questo plasmide di partenza si fa un single strand, si annila l’oligo (come prima), ma si annila anche un altro oligo che porta il gene wild-type per la resistenza all’ampicillina. In pratica ho un annealing con due oligo e due misMatch. Aggiungo, come al solito, polimerasi (T4 o Kleenow a scelta), aggiungo nucleotidi, faccio avvenire la synth del 2° strand e aggiungo ligasi per chiudere il nick.
Avrò un plasmide ds in cui lo strand interno porterà il gene TetR, il gene AmpS, e il gene X wild-type, e lo strand esterno porterà il gene TetR, il gene AmpR, e il gene X mutato.
Trasformo Coli, seleziono Tet e Amp, cresceranno solamente le colonie che avranno ricevuto lo strand modificato. In questo modo tutti i cloni che ottengo sono mutati, come resa totale saranno di meno, ma non ho un altro screening da fare (selezione 100%). Ed infatti avevamo detto che la mutagenesi sito-diretta porta all’analisi di pochi cloni finali.

Metodo di Kunkel (o dei ceppi Ung–).
È sempre ssDNA, ma utilizza ceppi che sono Ung–.
Sappiamo che in genere l’Uracile non viene incorporato nel DNA, e se ciò dovesse accadere c’è un enzima, l’Uracile-N-Glicosilasi (Ung), in grado di riconoscerlo ed eliminarlo.
Inoltre il ceppo che vioene usato ha pure una mutazione che fa sì che la concentrazione interna di dUTP sia maggiore, in modo da competere con il dTTP. In questo modo io favorisco l’incorporazione nel DNA di U. (ing. metabolica della sintesi del timidilato).
Utilizzo questo ceppo di Coli per fare ssDNA, quindi con l’M13 posso infettare questo tipo di Coli, isolo l’ssDNA che avrà uno strand solo con le U al porto delle T, dopodiché sono in vitro.
A questo punto ho il mio oligo con la mutazione, fosforilato in 5’, faccio avvenire l’annealing, e sintesi del 2° strand, ligasi, plasmide ds che avrà lo strand interno con tutte le U al posto delle T nel gene X wild-type, quello esterno (fatto in vitro) con tutte le A nel gene X con la mutazione (mismatch).
Ora trasformo un ceppo di E.Coli normale, il suo sistema di riparo riconosce le U e quindi quel filamento viene degradato. Ne derivca che si replicherà solamente lo strand esterno, e, una volta che andrò a piastrare su ampicillina tutti i cloni che otterrò sono quelli con il mio gene mutato.