Questo tipo di mutagenesi prevede conoscenze approfondite della sequenza del DNA da mutare.
Abbiamo già visto una mutagenesi sito diretta tramite PCR.
In qualsiasi mutazione sito diretta io posso apportare qualunque modifica in qualunque posizione:
Introdurre una base;
Scambiare una base;
Togliere una base.

Estensione enzimatica del primer.
Posso farlo tramite PCR o utilizzando DNA circolare ss, dove ho clonato il mio frammento di interesse, qns dal DNA ds si fa il ss e da questo DNA con il YFG, si fa un oligo (di solito lunghezza 18-20 basi) che viene poi fosforilato in 5’. Questo oligo deve contenere nella zona centrale la sostituzione che vogliamo fare. Questo oligo si fa annealare al templato single strand, ci sarà ovviamente una zona di MisMatch, si aggiunge polimerasi (sappiam quale), si aggiungo nucleotidi, e c’è la reazione di polimerizzazione del secondo strand. Alla fine aggiungo la ligasi, c’è un fosfato in 5’ e avrò quindi una molecola circolare double strand. Con lo strand interno wild-type e lo strand esterno con la mutaz (e quindi il MisMatch).
Trasformo E.Coli, replicazione, selex su Amp, mi aspetterei di avere un 50% wild-type e un 50% mutati, questo in teoria. In pratica trovo in genere che solo un 20% possiede la mutazione. Questo perché E.Coli possiede un suo sistema interno di riparo e quindio io introduco un plasmide con misMatch, il sistema di riparo lo riconosce. Io di questo NON SONO CONTENTO.

PCR per la mutagenesi sito diretta
Se vogliamo mutare in modo specifico alcune basi della ns mix da amplificare. È basata su oligo a sequenza nota in cui le mutazioni sono state introdotte in posizioni predeterminate. È utile per cambiare la sequenza che codifica per un determinato aminoacido (codone). Prima della PCR esistevano tecniche di mutagenesi basate sullo stesso principio.

1) Mut. all’estremita’ dell’amplificato.
Intro di siti di restrizione utili al clonaggio successivo o per fare fusioni geniche: Voglio fondere A e B, A ha un sito ottimale, B no.
|––––A–––– Eco| |–!!!–Eco–––––B––––––|
La PCR ci viene incontro perché ci permette di amplificare il pezzo di gene che vogliamo fondere mettendogli all’estremità un sito per un enzima di restrizione compatibile con quello dell’altro gene. Con un solo passaggio (ligazione) possiamo analizzare il 1° gene tagliato unito a quello modificato all’estremità.

2) Mut. all’interno dell’amplificato.
Uso PCR con “piedini adesivi” (sticky feet)
Amplifico con PCR il DNA da inserire in un gene clonato usando oligo con le ali.
Le ali sono rappresentate da nucleotidi aggiungoizzionali complementari al DNA del gene clonato, posto al confine del tratto in cui inserire il nuovo pezzo di DNA.
Denaturo il framm amplificato per ottenere la singola elica e la ibrido con il vettore a ssDNA contenente Uracile.
Estensione e ligazione.
Trasformazione di E.coli Ung+ e isolamento del DNA mutante.
Se il vettore iniziale è un vettore d’espressione posso cercare di capire come il pezzo di DNA inserito influenzi la funzionalità della proteina.

Metodologie diverse a seconda che sia una sequenza molto piccola o molto estesa
È come se avessimo 2 oligo vicini, connessi da un ponte che non si appaia.
Disegno di oligo. Una delle metodologie prevede il disegno di 2 oligo. Ogni oligo no comprende tutta la sequenza da inserire, ma solo un pezzo: un pezzo della sequenza da inserire e un pezzo della sequenza originale. Quello da inserire è scelto in maniera particolare: uno è comune a tutti e due gli oligo, in modo che si possano appaiare (è complemetare). Sono messi imodo tale per cui un enzima sceglie un oligo e va appaiare anche l’altro.
Ora faccio due reazioni di PCR, non li uso assieme dall’inizio: uso un oligomutagenico più un altro oligo completamente omologo alla sequenza da mutare. lo scegliamo inmoo che, formando 2 coppie (1 oligo mutagenico + 1 oligo omologo) ci permetta di avere metà della sequenza con inserzione della basi all’estremità. stessa cosa la facciamo con l’altra coppia. Con le 2 coppie faccio 2 reazione completamente separate, avrò: metà della copia del templato con mutazione all’estremità. L’altra reazione ci dà l’altra metà con l’altro pezzo di mutazioni. Abbiamo quindi diviso l’inserzione in 2 parti: inseriamo in pezzo in un amplificato e un pezzo nell’altro amplificato. La caratteristica dei 2 pezzi è il loro self appaiamento: mischio le 2 metà mischiando il prodotto della reazione A con il prodotto della reazione B. Mischiandole, denaturo, faccio avvenire l’annealing con le estremità (che coincidono con gli oligo disegnati all’inizio). [notare bene l’orientamento dei 2 filamenti che si appaiono solo 5’–>3’: con l’orientamento invertito la polimerasi non può fare assolutamente niente] Ora le polimerasi procedono e completano il ds. Ottengo una copia del templato di partnza più il templato che ho inserito (quella zona in più). D’ora in poi, utilizzando gli oligo alle estremità ottengo l’ampli del templato più il pezzo aggiunto.
Il vantaggio è che tutto questo lavoro si fa un un giorno. Modificando il templato di partenza ci vuole un mese.