Abbiamo pure quella suc2 che codifica per l’invertasi. Quello che si fa in genere è il gene suc2 con la sua sequenza segnale, uno excide e clona upstream del mio cDNA la sequenza segnale in questione.
Le sequenza che io scelgo possono essere omologhe o eterologhe, in genere è meglio esprimere un prodotto eterologo utilizzando elementi omologhi al sistema, perché ovviamente verrano più facilmente riconosciuti.
Nella maggior parte dei casi indirizzo i miei prodotti lungo la via secretiva.
Il fatto di indirizzare un prodotto verso la via secretiva favorisce quello che è il folding, perché a livello del reticolo ci sono chaperonine (BIP) e altra roba che modifica post-traduzionalmente.
È importante anche quella che è la scelta dell’ospite: in funzione dell’ospite io avrò la capacità di avere più o meno un certo tipo di modificazione.

Modificazioni post-traduzionali:
- Glicosilazione (di tipo n o di tipo o);
- Acetilazione;
- Miristilazione (attacco di un ac.miristico, in genere avviene in N-term);
- Fosforilazione;
- Acilazione (es. Ras con ac.palmitico attaccato e isopreni. Queste modificazioni avvengono a livello del C-term a livello del reticolo e dell’apparato del Golgi).
- Gipilazione (attacco di una struttura molto complessa che si chiama Glicosil Fosfatidil Inositolo, un lipide a cui è attaccato un ac.grasso, che viene attaccato un C-term alle proteine previa rimozione di una sequenza idrofobica in C-term. ad opera di una transammidasi, che taglia e attacca Questa struttura GIP. Questa struttura serve per l’ancoraggio in membrana, e ulteriormente modificata la troviamo poi in quelle proteine che ad esempio in lievito costituiscono la parete cellulare ovvero le proteine associate ai glicani che poi caratterizzano la permeabilità. Molte proteine devono essere tagliate per essere attive, un altro esempio è l’(a) factor).
- Formax di ponti di solfuro (disulfide isomerasi)
- Assunzione del corretto folding.
Nel caso di E.Coli c’è q.che problema con l’espressione, perché molte di queste modificazioni non avvengono, quindi non sempre Coli è l’organismo migliore.
Molto spesso, se io voglio produrre, io voglio anche purificare per ottenere il prodotto, ecco perché la via secretiva è migliore: è più facile purificare q.cosa dal medium che no dover rompere le cellule ecc…

Un organismo usato frequentemente per produrre grosse q.tà di proteine eterologhe è S.Cerevisiae,
Vantaggi:
Il fatto che avvengono modificazioni post-traduzionale.
Sistema di targeting: posso indirizzare in diversi comparti la proteina in questione.
Svantaggi:
La N-glicosilazione avviene su un consenso di 3 residui: Asparagina–X–Serina/Treonina. Questo tipo di modificazione è abbastanza conservata e avviene a livello del reticolo (attacco del core) e a livello del Golgi (attacco delle catene laterali). Mentre il core è abbastanza conservata (pentasaccaride comune), quello che varia in vari organismi sono le catene laterali. In lievito abbiamo solo mannosi, mentre in altri organismi abbiamo strutt. più complesse, quindi è chiaro che se ci sono alcune proteine la cui funzionalità è legata a modificazioni della parte glucidica, noi mettiamo queste proteine in lievito, questo ci mette solo mannosi e ciao! In più il lievito ha un vizietto: appena vede siti di glicosilazione gli attacca glucidi, quindi spesso abbiamo fenomeni di iperglicosilazione. E siccome i glucidi sono legati a fenomeni di antigeneicità (si pendi ai gruppi sanguigni), per cui vengono molto spesso dei prodotti che non è il caso di usare per via endovena. In questo caso si utilizzaranno altri organismi che avranno rese minori ma controllano meglio la glicosilazione, per es. Pichia Pastoris, un lievito sempre gemmante che cresce su metanolo.
Gli svantaggi di Pichia è che non ha un plasmide endogeno come 2µ, e i 2µ di Saccharomices non funzionano, per cui è possibile trasformarlo solamente con integrazioni, con efficienze di trasformazione inferiori. Alternativamente a Pichia si usano alcuni funghi come gli Aspergilli, che sono organismi gras come Cerevisiae, sono ascomiceti, anche qua però c’è la trasformazione solo con integrazione.

Un ulteriore problema è dato dallo Scaling Up industriale difficile: spesso le strategie di produzione di proteine in LAB non sono compatibili con le strategie di larga produzione su scala industriale, e viceversa. Questo è un problema se la proteina espressa ha un valore commerciale.

Riassumendo: per esprimere q.cosa bisogna tener conto di diversi fattori: il messaggero dev’essere stabile, il prodotto deve essere stabile, quindi ho si usano ceppi proteasi negativi o si fanno proteine di fusione. Posso anche inserire q.cosa che mi permetterà dopo la purificazione del prodotto (TAG inseriti in C-term o in N-term, x es. targeting di Histidine ripetute: queste si legano allo zinco, quindi una volta che il prodotto di fusione viene espresso e secreto io lo faccio passare su colonne di zinco, la proteina di fusione viene immobilizzata e successivamente eluita). Molto spesso dopo questo TAG vengono messi dei segnali specifici di modo che il TAG possa essere eliminato (a me interessa la proteina), quindi io eluisco, taglio eliminando il TAG e faccio passare ancora sulla colonna, il TAG si lega e io recupero la proteina purificata.