4) Mutagenesi Random Localizzata (Mutagenesi a cassetta).
Ho il mio gene clonato nel plasmide, di cui conosco la mappa di restrizione, ho deciso che devo modificare una certa zona del mio gene, sostituisco questo frammento con una cassetta (coppia di Oligonucleotidi sintetici, che io ho sintetizzato con delle mutazioni). Tolgo il pezzo wild-type ds con tanto di linker e riclono quello che voglio, ottenendo un gene mutante. Trasformo Coli e seleziono.
Come faccio ad ottenere oligo mutati? Si usano oligonucleotidi drogati.
Dovete sapere che gli oligonucleotidi vengono sintetizzati da opportune macchine per cui, viene imposta la sequenza e ci sono 4 boccettine da cui vengono pescati gli (A, T, C, G)TP in giuste concentrazioni. Se nella boccettina delle A io ci metto un po’ di C, la macchina non lo sa, e casualmente pesca. Io posso tra l’altro controllare la frequenza: vedo quanta [C] mettere nella [A]. Faccio la stessa cosa per l’altra elica, ci sarà una certa percentuale di mismatch, e alla fine unisco le 2 eliche. Alcune si appaieranno bene, alcune si appaieranno poco, altre non si appaieranno, avrò quindi una mix di ds di vario tipo. Come al solito devo renderli clonabili, quindi aggiungo ligasi + linker, taglio con gli enzimi opportuni, (il solito discorso di metilazione se non conosco la sequenza e voglio evitare che un’enzima di restrizione mi rompa l’oligo non si pone perché io conosco la sequenza.), clono, trasformo Coli, seleziono su Ampicillina e avrò un certo n° di cloni, mi metto a sequenziarli tutti, andando a vedere dove ho introdotto le mutazioni, scarterò le wild-type e a seconda del tipo di studio mi sono preposto, sceglierò quale reintrodurre nell’ospite e vedere di nascosto l’effetto che fa.

5) Modifica dei siti di restrizione.
Posso pure modificare (riempire o smangiare) dei siti di restrizione, questo è un modo per introdurre una mutazione. Prendiamo Eco, so che all’interno del mio gene c’è un sito Eco. Taglio con Eco, questo lascia estremità 5’-protruding, posso fare due cose:
- tratto con nucleasi S1, che riconosce i ss e rende blunt,
- oppure col frammento di kleenow posso fare fill in (in funzione delle caratteristiche del frammento di kleenow) che agisce sull’estremità 5’ protruding e riempie (pol 5’-->3’ eso) e quindi introduco delle basi, se poi rilego, ho modificato il mio gene.
Se usare la nucleasi o la kleenow, lo scelgo io, tenendo presente che io introduco mutazioni, ma non voglio mandare tutto fuori frame! Mutagenizzare significa cambiare un aminoacido, non tutto.

6) Inserzioni di linker (linker scanning).
Anche qua modifico le dimensioni del mio gene, le prime volte è stato fatto per studiare i trasposoni. Ho il mio gene, lo clono nel vettore e tratto con na cosa che abbiam già visto: in funzione della DNAasi_I (+ Mn++) che ho posso ottenere tagli random su entrambe le eliche, quindi avrò il plasmide linarizzato in diversi punti. A questa miscela aggiungo ligasi e dei linker, linker che hanno al loro interno un sito di riconoscimento per enzimi di restrizione. Questi si attaccheranno alle estremità delinearizzate, che hanno estremità diverse. aggiungo i linker, dopodiché devo tagliare con Eco, in modo da avere estremità compatibili. Riaggiungo ligasi in modo da ricircolare i plasmidi.
Siccome i tagli sono stati random, e quindi avrò una miscela di plasmidi linearizzati in diversi punti, io aggiuso le condix di taglio in modo tale che ciascun plasmide sia tagliato in media solo una volta. I miei linker sono introdotti in diversi punti del mio plasmide. Avrò una mix di plasmidi con inserito random il mio sito Eco. (questo sempre in vitro). Trasformo Coli, in quei plasmidi in cui la mutazione permette comunque la replicazione, ne avrò un certo numero, io ho inserito Eco, posso usare Eco e fare la mappa di restrizione per vedere dove il sito Eco si è inserito, e scegliere quindi quelli che presumibilmente hanno inserito all’interno del gene in una zona di mio interesse, senza dover sequenziare tutta la baracca.

7) Bal_31 e Eso_III
Queste robe possono creare una delezioni bidirezionali, l’altra solamente da una parte sola.
Ricordiamo che Bal31 dipende dal Calcio, come prima reazione smangiava, poi si metteva a bluntare. Abbiam detto attività Eso, sia su estremità 3’ e 5’ sia blunt che protruding.
Allora, io ho il mio gene clonato nel plasmide, in questo caso è un gene della sub.tà 5S del RNA ribosomale. Taglio con un enzima di restrizione. Mi interessa, del gene che ho isolato, studiare, x es., la zona in 5’. Taglio il sito unico e si linearizza. aggiungo la Bal31 col Calcio, questo comincia a smangiare, ma io a diversi tempi fermo la reazione e prelevo delle aliquote. Bal31, a differenza della Eso3, smangia in tutti e due i sensi, (smangia il mio gene ma anche il plasmide).
As un certo punto la mia mix avrà estremità blunt, questo vuol dire che posso aggiungo dei linker con siti di restrizione, sempre con la ligasi (rendo clonabili le estremità). Tuttavia, siccome ha smangiato il mio gene, ma ha smangiato anche il plasmide, può essere che sia andata a toccare q.che sito sacro come Amp o Ori, percui devo estrarre il mio gene dal vecchio plasmide tagliando con il secondo enzima che isola il mio gene e inserirlo in un plasmide nuovo.
Con questo vado a trasformare E.Coli, selezionerò per ampicillina, estraggo il plasmide dai Coli cresciuti, sequenzierò e quindi andrò a trasformare l’ospite originario, vedendo cosa succede.
In genere questo tipo di analisi è usato per modificare la regione 5’ del gene, quindi le zone promotori. io voglio vedere se la zona 5’ è capace di indurre trascrizione, e fino a che base questo fa quello che deve fare, e se ci sono enhancer o se ci sono silencer.
Idem se mi interessa la fine: taglierò il 3’ e farò questo tipo di analisi.
Si preferisce Eso_III, perché ha la stessa attività exo 3’-->5’, ma agisce solo su estremità 5’ protruding o blunt ma non agisce su estremità 3’ che posso quindi proteggere (quella sul plasmide).
Come farò a proteggere? Faccio il primo taglio con con BamH1, che lascia estremità 5’ protruding, taglio poi con un sito adiacente Sti che lascia estremità 3’ protruding, aggiungo Eso3, questo smangia solo a partire dall’estremità 5’, solo in un senso. Eso3 non è un enzima che blunta, quindi il procedimento da seguire è lo stesso (prelievo di aliquote a tempi diversi), ma alla fine, per aggiungo i linker, io devo bluntare! C’è l’S1 che taglia i ss. Aggiungendola avrò varie miscele di delezioni in un solo senso. Ora devo richiudere, ma ho un estremità blunt da una parte e un estremità Psti, allora, o decido di bluntare Psti o aggiungo un linker Psti all’estremità blunt. Siccome Psti è 3’ non si usa la Kleenow (non filla le 3’ protruding).
Ora richiudo, ho il plasmide perfettamente funzionante, trasformo, bla bla bla.

Le tecniche di mutagenesi viste fin d’ora non necessitano di grandi informazioni sulla sequenza da mutagenizzare, sono quindi un tipo di mutagenesi che uno fa come prima analisi, perché mi danno informazioni preliminari. Successivamente si passa alla mutagenesi sito diretta.

Uso PCR per la mutagenesi casuale
Condix di amplificazione in cui si verifica con una frequenza opportuna, mutazioni di inserimento delle basi. Non ci interessa dove la PCR venga sbagliata, ci basta che ogni tanto metta delle mutazioni. Andremo poi a vedere gli effetti. Non ci servono troppe mutazioni: lo studio di una mutazione è impegnativo… Queste tecniche sono basate sul fatto che in certe condizioni l’enzima sbaglia l’incorporazione delle basi.
Polimerasi prive di attività di proof reading (che non controllano cioè l’accuratezza dell’appaiamento dell’ultima base) come Taq e derivate.
Alta [Mg++] anche una base incorporata in modo sbagliato, a concentrazione salina opportuna, riesce a stare abbastanza prossima al templato senza distorcere troppo la struttura della doppia elica.
[dNTP] sbilanciata: quello abbondante di alcuni ordini di grandezza (non basta il doppio) verrà introdotto al posto degli altri.
T annealing < Tm. Oltre ad inserire basi sbagliate facciamo annilare anche l’opposto sbagliato: la mutazione estrema.
Alta forza ionica, dipende dalla [ ]tot di ioni presenti, vale lo stesso discorso del Mg++.