Metilazione non associata ad attività endonucleasica.
Esistono in Coli sistemi di metilazione non accoppiati ad endonucleasi specifica, i sistemi principali sono i sistemi dam e dcm.

1. Il sistema dam riconosce la sequenza GATC e metila la A. Purtroppo questa sequenza è presente all’interno di molti siti di restrizione di enzimi quali BamHI, Sau3A e DGL2 che sono quelli che riconoscono sequenza diverse ma lasciano estremità compatibili (isocaudameri)

·         La sequenza GATC può anche essere in parte dentro al sito di restrizione e dare comunque problemi ad alcuni RE come ad esempio CLA, la cui sequenza di riconoscimento è GAT. Se per caso subito dopo c’è una C nella seq, la sequenza viene metilata e CLA non taglia più. La probabilità è, ovviamente, uno su 4.

·         Altri come XDA1 hanno probabilità inferiori: c’è solo GA, ma se dopo c’è una T e una C, (1/16) sarà metilato e non taglia più.

2. Il sistema dcm invece riconosce 2 sequenze, CC^A/_TGG e viene metilata la C.

Perché ci dice questo? Questo è un sistema che funziona in vivo, dentro E.Coli, non tutti i ceppi di Coli che vengono utilizzati in lab mancano di questo sistema di metilazionie, percui se sono presenti questa metilasi noi dobbiamo saperlo: a monte di ogni passaggio in Coli c’è sempre q.che passaggio in vitro, dove queste metilasi non ci sono…

• Mettiamo che, per riprendere il discorso di prima, ho deciso di fare dei bellissi linker con dei siti XDA o CLA: metilazione in vitro sul frammento–>attacco i linker–> taglio–>vado a clonare–> trasformo Coli e se non ho visto che Coli mancava del sistema dam, il DNA è metilato e una volta che lo recupero e voglio excidere il frammento, non ottengo più niente.

• Oppure voglio fare una mutagenesi e inserisco il sito CLA o XDA all’interno del gene, la mutagenesi si fa in vitro per cui ho tutto sotto controllo, metto a sito attivo, inserisco un sito XDA in modo che poi la proteina corrispondente non è più attiva, tutto bello, trasformo Coli, questo viene metilato, e ricomincio da capo.

I sistemi che si usano normalmente, non tutti mancano di queste metilasi: per poter utilizzare Coli in laboratorio dobbiamo modificarlo di parecchio! Devo togliere tutti i sistemi di restrizione, tutti i sistemi di metilazione, devo fare in modo che Coli (che sta anche nel nostro intestino come commensale) non si propaghi ovunque, se per x motivi mi mangio un Coli ricombinante… Tutti i Coli da laboratorio hanno una serie di mutazioni, e q.cosa dobbiamo pur lasciargli, ma non li useremo per le trasformazioni.
Esiste un altro RE, DPM1 che funziona al contrario: riconosce e taglia in modo specifico la sequenza GATC quando la A è metilata, e viene usato quando? quando voglio eliminare q.cosa che mi può dar fastidio, come il templato originale di una PCR.
La PCR prevede una reazione in vitro di polimerizzazione a partire da un templato su cui mettero degli oligo, e amplificherò un frammento X. Il templato di partenza ha tutte le caratteristiche dell’origine da cui l’ho isolato (tutte le sue belle metilazioni e abbastanza frequentemente) il frammento amplificato con PCR invece non ce le avrà.
Alla fine avrò la mia provettina con dentro templato + prodotto, e a me interessa il prodotto. Io devo clonare il prodotto, anche se il templato è pochissimissimissimo ma c’è, e devo eliminarlo. Uno dei modi (ce ne sono altri) è trattare la miscela con DPM1 perché questo idrolizzerà il mio templato e non il frammento, che potrà essere clonato (dopo separazione della mix di digestione).

Metodi di purificazione dei frammenti di restrizione.
Immaginiamo che io abbia digerito con Hind, ho 10 frammenti. Come faccio ad isolare i 2-3 che mi interessano dalla mia miscela? In tutti i casi si carica su gel di agarosio e si ottengono delle bande, si guarda fisicamente al transilluminatore utilizzando lunghezze d’onda diverse da quelle che mi permettono di vedere il DNA, perché non voglio danneggiarlo (devo usarlo!) con un bisturi piccolo piccolo taglio la banda e la metto in una provetta e con kit posso estrarre in modo specifico la banda che mi interessa. Questo passaggio è un po’ più lungo rispetto al trattamento dell’idrolizzazione, in cui ottengo frammentini che non rompono il cazzo, invece in questo modo devo:
caricare su gel–> fare correre–> colorare–> andare a guardare–> tagliare–> eluire–> controllare che abbia eluito q.cosa e a quel punto sono pronto (per trasformare?).
I metodi di purificazione sono moltissimi, quando uno lavora mette sempre in conto: tempo, resa e costo.