È un’analisi sui prodotti, e i dati sono ancora di più. Si sta cercando di farla anche sul 2 hybrid sistem. Bisogna fare tutte le fusioni con il dominio di attivax e con il dominio di legame, e poi mettere in piedi un sistema di screening, --> analisi a tappeto.
In questo caso, invece del chip abbiamo elettroforesi bidimensionale.
Il primo problemino è che non vendono elettroforesi bidimensionali rappresentative di un certo organismo.
Ho una collezione di cellule, devo estrarre le proteine in modo ri-pro-du-ci-bi-le, e farci un elettroforesi bidimensionale. In commercio ci sono strisce dove sono già presenti immobiline con gradienti di pH, mentre una volta uno doveva farsele da solo. In genere si usa un gradiente di pH abbastanza ampio, anche se si perdono cmq quelle proteine molto basiche che sono le proteine ribosomali. Faccio avvenire la corsa e ho una strisciolina con le proteine separate in base al punto isoelettrico. La strisciolina viene quindi depositata su una lastra di gel (c’è una fessura al posto dei pozzetti), e faccio il solito SDS-PAGE con separazione in base al MW. I gel quindi vengono o colorati con il Nitrato d’Argento, che è molto più sensibile del Coomassie, visto che mi interessa scovare proteine poco presenti, oppure blotto il gel e ci faccio un immunodecorazione ecc…, quindi il gel viene messo in un sistema automatizzato (che costa una cifra) che prende la spot e la isola. E siccome 700 milioni non me li dà nessuno, lo faccio manualmente. Questa è l’analisi di primo acchito. Quando poi vado ad approfondire facendo il focusing di una singola zona, vedo che uno spot è fatto da n proteine, con n = 200. Ora entrano in gioco tecniche Maldi-Tof (spettrometria di massa) o anche elettrospray, e questi metodi permettono di arrivare alla sequenza dei singoli peptidi. E una volta che uno ha la sequenza la prima cosa che fa è andare in banca dati, e se è fortunato trova già la proteina, altrimenti si va a cercare il gene ecc… La tecnica è ancora meno utilizzata del GeneChip.
Quindi siamo passati da tecniche che permettono l’analisi di un ristretto n° di geni a tecniche che in un singolo esperimento permettono di ricavare informazioni da un intero genoma.

Dall’inizio del corso fino ad ora, abbiam fondalmentalmente visto alcune tecniche di base che servono per quella disciplina che prende il nome di Ingegneria Genetica. Di fatto ci siamo interessati a giochicchiare con i geni: gli abbiamo clonati, mutati, sequenziati, espressi…
Ma la biotecnologia non è solo questo.
In genere tutte queste tecniche vengono applicate ad altre 2 grosse branche che forse un giorno vedremo:
L’ingegneria proteica e l’ingegneria metabolica.

Ingegneria Proteica.
Oggetto: proteine
Le proteine vengono ingegnerizzate, serve per studiare i rapporti fra struttura e funzione di una proteina.
Cambiando una Cys, in quel punto la prot. non mi fa più ponti disolfuro, quindi cambia la struttura e vado a vedere questo cosa comporta alla funzione;
Posso modificare una proteina al fine di aumentare la capacità di purificarla;
Posso modificare al specificità di substrato;
Posso cambiare la KM;
Posso renderla più stabile (più termostabile).

Ingegneria Metabolica.
Io sono in grado di modificare il metabolismo di un certo organismo. E creare come risultato finale quelle che i giornali chiamano “sostanze OGM”.
Per esempio:
Modificax del pathway della glicolisi. L’acido lattico è un prodotto importante in ambito industriale, sotto vari campi (in campo farmaceutico è usato come aggiungoitivo, usato come precursore di materiale pseudoplastico biodegradabile). In genere sono i batteri a produrlo, ma se il pH si abbassa troppo in cultura, i batteri crescono male (leggi: rese ridotte). Se al fermentatore aggiungo soda o bicarbonato, il pH si alza, ma invece di avere ac.lattico io ottengo il sale (lattato). Quindi devo poi purificare il lattato ed estrarre dal sale l’acido (leggi: aumento dei costi e diminuizione del valore aggiunto del prodotto che voglio vendere).
L’idea qual è stata?
Ci sono organismi, come Cerevisiae, che crescono benissimo a pH = 2-3, ma di lattato, con la glicolisi normale, il lievito non vuole saperne. Cosa faccio? Vedo il metabolismo di Cerevisiae e cerco di hackerare il sistema. L’acido lattico si può produrre dal Pyruvato, ma ci vuole la latticodeidrogenasi, che non è di serie con S.Cerevisiae.
Va bene trasformare il lievito ed aggiungergli il gene per la PyrDH, ma se non agisco anche sulle altre vie, non è che il il pyr non si trasforma in glc! Se non inattivo la PDC, questa stronza continuerà a rubarmi $$$! Si è visto che il lievito sopporta bene l’inattivazione della PDC e della PDH, (anzi, procedendo con la One Step Distruction si è visto pure che gli enzimi non erano codificati da un gene solo, ma da q.che gene).
Ed alla fine, si è riusciti ad ottenere ac.lattico, che tra l’altro attraversa le membrane e si riversa nel medium di coltura.