Gruppo di
Lavoro
Docente: Ricciarello Jumara
Studenti: Passeri Catia, Piatti Andrea, Gaxha Elona, Andalib Adel, Teatini
Laura, Ventanni Debora.
Docenti per le esperienze di laboratorio Chimico - biologico: Antognoni
Alfonso, Arcelli Serena, Ricciarello Jumara
ANALISI
CHIMICO - MICROBIOLOGICA DELLE
ACQUE DEL FIUME TEVERE
(zona La Bruna)
ANALISI MICROBIOLOGICA
Tecnica del prelievo
Per eseguire un analisi chimica e microbiologica delle acque del fiume che scorre in quel tratto, è necessario effettuare un prelievo in modo da avere un campione da esaminare, il prelievo va effettuato secondo i principi microbiologici di massima sterilità; bisogna quindi utilizzare un apparecchio da prelievo appropriato quali il “Sub 15” che è costituito da una particolare bottiglia in vetro graduato e sterile in cui va innescata una sonda alla cui asta superiore è agganciata una corda che ci permetterà di determinare la chiusura e l’apertura della sonda e quindi l’ingresso dell’acqua nella bottiglia in modo sterile.
1°
fase- FISSAGGIO DELLA BOTTIGLIA STERILE
Togliere
il tappo della bottiglia e avvitare quest’ultima nella parte inferiore della
sonda.
2° fase - CONTROLLO PRIMA
DELL’IMMERSIONE
Tenere l’apparecchio
con la bottiglia attaccata, sospesa per la funicella agganciata all’asta
superiore. Con un leggero strappo si provoca la caduta del tappo con
conseguente chiusura della bottiglia.
3°
fase - IMMERSIONE DEL PRELEVA CAMPIONI
L’apparecchio deve
essere immerso lentamente facendo scorrere la funicella che porta nodi a
distanza di 1m uno dall’altro per controllare la profondità.
4° fase - APERTURA
DELLA BOTTIGLIA PER IL RIEMPIMENTO
Una volta raggiunta la
profondità desiderata, attendere che la funicella si abbassi di scatto per
circa 40 cm. In questo modo si provocherà l’apertura della bottiglia e di
conseguenza si vedranno salire le bolle d’aria in essa contenuta; la
bottiglia sarà piena solo quando le bollicine non saranno più visibili.
5° fase - CHIUSURA IN
PROFONDITA’ DELLA BOTTIGLIA DOPO IL RIEMPIMENTO
Con uno strappo verso
l’alto eseguito velocemente si provoca la chiusura ermetica della bottiglia.
6° fase - RITIRO
DELL’APPARECCHIO IN SUPERFICIE
Dopo lo strappo per la
chiusura, evitare nuove scosse repentine, procedendo al ritiro della
funicella in modo graduale, continuo e lento. Appena fuori dell’acqua,
svitare la bottiglia e chiuderla con il tappo.
ANALISI MICROBIOLOGICA DELLE ACQUE
L’analisi microbiologica delle acque prevede un analisi di tipo quantitativo e qualitativo dei microrganismi.
I metodi utilizzati sono:
1) conta batterica
totale su terreno agarizzato in piastra;
2) metodica
dell'MPN ( Most Probable Number).
I campioni utilizzati sono acque del fiume Tevere e le acque del Fosso del Pantano.
Il metodo dell'MPN si fonda sullo sviluppo dei microrganismi in terreni di coltura liquidi e sull'osservazione della crescita attraverso l'intorbidimento del terreno o il rilevamento di particolari attività metaboliche presenti in alcune specie batteriche. Le colture che dopo l'incubazione evidenziano le caratteristiche saggiate sono considerate positive al test, mentre sono considerate negative le colture che, pur rilevando la crescita, non consentono il riscontro della produzione di gas.
Se vogliamo, per esempio, ricercare batteri coliformi nell'acqua, si procederà alla semina del campione in una serie di provette contenenti un particolare terreno di coltura, il brodo lattosato. Quest'ultimo è allo stesso tempo un terreno selettivo, in quanto inibisce la crescita dei batteri Gram+, e un terreno d’identificazione, in quanto contiene, come substrato fermentabile, il lattosio. I coliformi sono in grado di fermentare il lattosio con produzione di gas. Pertanto l'osservazione della formazione del gas, che si raccoglie in apposite campanelle introdotte inizialmente nel terreno e che, se quantitativamente rilevante, fa risalire in superficie le campanelle stesse, indica la positività del test. È possibile peraltro avere intorbidamento o cambiamento di colore del brodo – segnali, questi, della presenza e dello sviluppo di microrganismi – senza avere produzione di gas. In tal caso la prova è da ritenersi negativa in quanto la crescita non è attribuibile ai coliformi, bensì ad altre specie contemporaneamente presenti nel campione. È evidente dunque che il metodo può essere applicato solo nella numerazione di popolazioni pure o di popolazioni miste in cui le specie ricercate siano chiaramente distinguibili dalle altre.
Con questo metodo il numero dei batteri presenti nel campione si calcola mediante una stima su base probabilistica, basata sulla determinazione del cosiddetti indice MPN (Most Probable Number) che rappresenta il numero più probabile di microrganismi contenuti in un volume noto del campione in esame.
Per calcolare l'indice MPN si utilizzano 18 provette, 9 per il LATTOSIO DEKTROSE BROTH ( 6 a concentrazione normale e 3 a concentrazione doppia) e 9 per L’AZIDE DEKTROSE BROTH (6 a concentrazione normale e 3 a concentrazione doppia). Per la concentrazione normale di lattosato è utilizzato 3,25 gr di terreno sciolti in 250 ml d’acqua mentre per la concentrazione doppia del lattosato sono utilizzate 3,38 gr di terreno sciolti in 130 ml d’acqua. Per quanto riguarda la concentrazione normale d’Azide, si è utilizzato 8,75 gr di terreno in 250 ml d’acqua e in quella doppia 9,10 gr di terreno in 130 ml d’acqua.
Il lattosio dextrose broth è utilizzato per la ricerca dei coliformi mentre l’Azide dextrose broth è utilizzato per la ricerca degli streptococchi fecali. Inoltre in ogni provetta per rilevare la positività aggiungiamo una campanella di Durhan che raccoglierà il gas prodotto dal metabolismo dei microrganismi presenti.
Ogni serie di provette è seminata con una quantità scalare di campione: nelle provette a concentrazione normale si seminerà in tre provette 1 ml di campione e nelle altre tre 0.1 ml, mentre nelle provette a concentrazione doppia 10 ml di campione.
Questa semina scalare permetterà lo sviluppo sia dei pochissimi batteri presenti nel campioni (10ml) sia la visibilità se il numero dei batteri del campione fosse elevato (0.1ml).
Dopo l’incubazione a 36°c, le prove positive saranno date dalle provette con intorbidamento e produzione di gas rilevabile dalla risalita delle campanelle di Durhan.
Per determinare l’indice M.P.N si contano le provette positive per ogni serie di tre e tramite apposite tabelle si risale al numero più probabile di microrganismi della specie ricercata.
Dopo incubazione per 24 h, la lettura delle prove è stata: per il brodo lattosato sia per il campione dell’acqua del Tevere che per quella del Fosso del pantano tutte le tre serie di provette sono positive, mentre la serie dell’Azide dextrose broth sono per ambedue i campioni negati.
A questo punto si dovrà passare all’analisi qualitativa per verificare che i Coliformi presenti non siano d’origine fecale. Pertanto si dovrà approntare una serie di provette con un terreno molto selettivo come il Brilliant Green Bile al 2% Broth che permetterà di determinare se la crescita riscontrata sia dovuta a coliformi ambientali o fecali. Ciò è possibile in quanto il terreno suddetto per la presenza della bile facilita la selezione dei batteri non fecali ed inoltre si effettuerà un’incubazione a temperature differenziate (a 36°C e a 44° C ) in quanto i coliformi fecali cresceranno solo a 44° C. Sono state preparate, quindi, 18 provette di Brilliant Green Bile2% Broth per ogni campione d’acqua analizzato in quanto per ogni provetta di brodo lattosato positiva se ne preparano due di brilliant green bile 2%, poiché una provetta sarà incubata a 36°C per la conferma della presenza di coliformi ambientali ed una a 44 °C per verificare la presenza di coliformi fecali. Dopo incubazione per 24 /48 h la lettura delle prove ha dato questi risultati: tutte le provette incubate a 44°C sono negative, mentre quelle incubate a36°C soltanto 3 sono positive confermando l’ipotesi di presenza di coliformi ambientali.
La tecnica di conta in piastra invece, si basa sul fatto che ogni singola cellula microbica viva, inoculata in piastra in un terreno agarizzato e incubata in condizioni idonee alla crescita, si riproduce formando una colonia visibile ad occhio nudo.
Se si opera in modo
tale da ottenere colonie separate spazialmente le une alle altre, contando
le colonie sviluppatesi nel terreno, si può risalire al numero di
microrganismi presenti in un volume noto del campione. Per ottenere colonie
singole, valutabili numericamente, è opportuno che la popolazione batterica
non sia particolarmente elevata in quanto, in caso contrario, le cellule
sarebbero in numero tale da originare colonie non separate, ma unite e
sovrapposte. Quest'ultimo tipo di crescita, detta confluente, impedisce un
conteggio preciso ed è per questo che occorre sottoporre il campione di
partenza a delle diluizione successive, tale da ridurre la concentrazioni
delle cellule e ottenere delle piastre in cui le colonie risultino
numerabili. Le diluizioni più comunemente utilizzate sono quelle decimali,
in cui ad ogni passaggio la concentrazione cellulare è ridotta di un fattore
10. In questo caso il numero di microrganismi, presenti in un volume del
campione, è determinata moltiplicando il numero delle colonie per l'inverso
del fattore di diluizioni, cioè il numero effettivo si ottiene considerando
sia il numero di colonie cresciute sia la diluizione utilizzata. Il
conteggio delle colonie può essere effettuato manualmente o per mezzo di
strumenti conta colonie di diverso grado d'automazione.
Il metodo della conta in piastra presenta un elevato grado di sensibilità, in quanto consente di rilevare un numero molto piccolo di microrganismi presenti nella sospensione. L'accuratezza del metodo, cioè la possibilità di registrare il numero di microrganismi il più vicino possibile al numero reale presente nel campione, dipende invece da una serie di fattori soprattutto di tipo operativo. Per una migliore accuratezza è importante diluire il campione in modo tale da ottenere delle piastre contenenti un numero di colonie compreso tra 30 e 300. Una conta di meno 30 colonie è, infatti, soggetta ad errori statistica e di campionamento, mentre al di sopra delle 300, oltre ad essere difficile da eseguire, è poco attendibile per il sovraffollamento e l'insufficienza di nutrienti.
La crescita in piastra – come peraltro la maggior parte dei metodi microbiologici – richiede, per la conoscenza dei risultati, un tempo d’attesa piuttosto lungo, determinato dalla durata dell'incubazione necessaria per evidenziare colonie visibili. Tale intervallo varia tra le 18 – 24 ore della specie a maggior velocità e le 72 o più ore delle specie a crescita lenta.
Dalle caratteristiche esposte, è facile rilevare come la conta in piastra sia un metodo piuttosto versatile, adattabile alla determinazioni di popolazioni miste e pure e alla valutazione di campioni la cui carica presunta può essere indifferentemente molto elevata o molto bassa.
PREPARAZIONE TERRENI DI COLTURA
|
Concentrazione
normale 13 gr x 1 litro d’acqua 13 gr : 1000 ml = x : 250 ml x = 3,25 gr di lattosio destrosio broth 250 ml di acqua |
Per conta
batterica totale Plate Count Agar 23,5 gr/l per 12 piastre 23,5:1000= x:250 x= 5,87 gr |
|
Concentrazione doppia
26 gr x 1 litro di
acqua
|
|
|
Concentrazione
normale 35 gr x 1 litro di acqua 35 gr : 1000 ml = x : 250 ml x = 8,75 gr di azide destrosio broth 250 ml di acqua |
Analisi
qualitativa delle acque Brilliant Green Bile 2%Broth 40gr/l 40:1000=x: 300 x=12gr |
|
Concentrazione
doppia |
LETTURA PROVETTE TERRENO LIQUIDO
| “PANTANO” | “TEVERE” |
|
BRODO LATTOSATO: 1 ml tutte e 3 positive 0,1 ml tutte e 3 positive 10 ml tutte e 3 positive |
BRODO
LATTOSATO:
1 ml tutte e 3 positive 0,1 ml tutte e 3 positive 10 ml tutte e 3 positive |
|
AZIDE: 1 ml tutte e 3 negative 0,1 ml tutte e 3 negative (concentrazione normale) 10 ml (doppia) tutte e 3 negative |
AZIDE: |
|
0,1
concentrazione normale |
|
Consultate le tabelle dell’indice MPN il valore più probabile di coliformi presenti è di 83 coliformi e zero streptococchi fecali, mentre la conta batterica in piastra su PCA ha una media di colonie pari a 40.
CONCLUSIONI
Alla luce di quanto ottenuto dall’indagine microbiologica delle acque del Tevere e del fosso del Pantano, possiamo concludere che nessuno dei campioni è contaminato da batteri fecali; tuttavia le tecniche utilizzate non garantiscono l’assenza totale d’altri microrganismi patogeni (Salmonella) o patogeni opportunisti (Pseudomonas aeruginosa) per i quali sono richieste analisi di laboratorio più specifiche. L’esperienza, in ogni modo, è stata molto interessante e formativa e con una particolare ricaduta a livello curricolare perché ci ha dato modo di sperimentare una metodica di laboratorio in uso, per esempio, nei laboratori dei distretti socio-sanitari (area ambientale) che sovrintendono alla tutela ambientale e alla salute del cittadino.
ANALISI CHIMICA DELLE ACQUE
I corsi d’acqua, scorrendo dalla sorgente verso altri fiumi o verso il mare, attraversano aree e territori di varia natura e ricevono acque che, dopo essere state utilizzate per usi industriali, agricoli o civili, vengono eliminate perchè ormai inservibili per lo scopo cui erano destinate.
Esse però possono contenere sostanze disciolte o sospese, spesso nocive alla fauna ed anche alla flora; per questo è necessario sottoporre le acque dei fiumi ad analisi chimiche e microbiologiche per assicurarne la compatibilità con l’ambiente circostante.
Le analisi eseguite sono state:
- Nitrati
- Nitriti
- Fosfati
- Cloruri
- Durezza totale-permanente
- pH
- Conducibilità
Durezza
totale:
Per durezza s’intende la quantità di calcio, magnesio ed altri metalli pesanti disciolti nell’acqua.
Si misura in gradi francesi (°F) e si esprime in grammi di carbonato di calcio in 100 litri d’acqua: ogni grammo corrisponde ad un grado francese.
Viene determinata con il metodo complessimetrico, 100cc di acqua vengono addizionati con 20cc di tampone ammoniacale (pH10) ed una piccola quantità di nero eriocromo T (indicatore): si titola con EDTA 0.01 N.
I millilitri d’EDTA usati corrispondono alla durezza in gradi francesi.
Durezza permanente:
Il campione d’acqua di 100cc viene fatto bollire per 30 min e si riporta con acqua distillata al volume iniziale, dopo di che si procede come sopra indicato.
Avvengono le seguenti reazioni:
2CaHCO3 = CaCO3+H2O+CO2
2MgHCO3 = MgCO3+H2O+CO2
I carbonati di calcio e magnesio precipitano e a questi si attribuisce la durezza temporanea; ciò che rimane è la durezza permanente.
Durezza totale = Durezza permanente + Durezza temporanea.
|
Durezza |
<7 |
7-14 |
15-22 |
23-32 |
33-54 |
>54 |
|
Acque |
Molto dolce |
Dolce |
Poco dure |
Mediamente dure |
Dure |
Molto dure |
Cloruri:
La determinazione dei cloruri permette di determinare la quantità di ioni cloro per litro nell’acqua in esame. Un’eccessiva concentrazione di ioni cloro non consente di usare l’acqua del fiume per l’agricoltura.
Nitriti:
La presenza di questi Sali indica che l’acqua del fiume durante il suo percorso ha attraversato materiale in putrefazione secondo la seguente reazione:
NH4
+ + 3/2 O2 NO2-
+ 2H + H2O
Nitrati:
Rappresentano l’ultimo stato di ossidazione dell’azoto e per questo non sono più in grado di consumare ossigeno la loro presenza non è quindi dannosa.
NO2-
+ 1/2 O2 NO3-
Fosfati:
Questi sali sono i residui delle attività agricole e la loro presenza è indice d’inquinamento.
pH:
Il pH ci fornisce indicazione sul tipo di terreno che le acque attraversano:
- terreni calcari forniscono pH basici
- terreni con solfati forniscono pH basici
Conducibilità:
Ci da indicazioni sul contenuto di sale disciolto in acqua, in generale si può affermare che a conducibilità elevate corrisponde un alto contenuto di sali.
Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti delle analisi effettuate con le metodiche sopra indicate.
|
Durezza Totale |
Durezza Permanente |
Durezza temporanea |
[Cl] |
[NO3] |
[NO2] |
[PO4] |
pH |
Conducibilità |
|
28.3°F |
11°F |
17.3°F |
19.6 mg/l |
10 mg/l |
0.5 mg/l |
10 mg/l |
7.15 |
1.46 S/cm |
Conclusioni
Dai risultati ottenuti non risultano esserci inquinamenti né di ordine organico né chimico di origine agricolo-industriale