Tuthmosi I era figlio illegittimo di Amenofi , che aveva avuto dalla moglie soltanto delle figlie, e di una donna di sangue non regale di nome Senisonb. Le donne in Egitto potevano regnare, ma non da sole. Fu quindi il figlio naturale di Amenofi, Tuthmosi, che salì al trono e, per rafforzare il suo potere, sposò la sua sorellastra Ahmose, la legittima erede al trono.
Il primo atto ufficiale di Tuthmosi I fu quello di mandare a Turi, viceré della Nubia, uno scritto per annunciargli la propria assunzione al trono; nel documento esponeva per esteso tutti i titoli con i quali voleva essere riconosciuto e che si dovevano usare in occasione delle offerte agli dei e nei giuramenti prestati in suo nome. Proseguendo la politica dei suoi predecessori in Nubia, Tuthmosi I giunse fino alla quarta cataratta; una grande epigrafe del suo secondo anno di regno è incisa su una roccia di fronte all'isola di Tombos a monte della terza cateratta, ma è più ricca di frasi magniloquenti che di notizie concrete. Un fatto d'armi più importante fu la spedizione che attraverso l'Eufrate penetrò nell'interno di Nahrin, territorio del re dei Mitanni, dove fu collocata una stele commemorativa e dove avvenne una carneficina di nemici e furono fatti molti prigionieri. Nel viaggio di ritorno il re festeggiò la vittoria con una caccia all'elefante nella regione paludosa di Niy, vicino alla città che si chiamò poi Apamea, in Siria. Per molti secoli solo un'altra volta, e precisamente sotto Tuthmosi III , un esercito egizio si spinse cosi lontano in direzione nord-est.
Non si sa quanto a lungo sia durato il suo regno, forse non più di dieci anni; l'ultima data certa registrata si riferisce al quarto anno. Una grande stele, che ricorda i lavori da lui fatti eseguire nel tempio di Osiride ad Abido, ha perso la data, se mai ne ebbe una. Se la mummia trovata a Deir el-Bahri è davvero la sua, la morte lo colse sui cinquant'anni. Nella disposizione del suo monumento funebre egli segui l'innovazione introdotta da Amenofi I, lasciando un grande spazio fra il tempio funerario e la tomba vera e propria, innovazione che fu copiata da tutti i successori. In realtà il tempio non è stato ritrovato, a meno che non fosse incorporato in quello della figlia, Hatshepsut. La tomba è la più antica di quelle trovate nella remota valle di Biban el-Muluk ("Tombe dei Re"), e consiste in una ripida scala d'ingresso che scende in un'anticamera adiacente alla sala sepolcrale dalla quale si diparte un piccolo ripostiglio, una cosa assai modesta confrontata ai grandi sepolcri che dovevano seguire. Il sarcofago di quarzite gialla trovato all'interno (ora al museo del Cairo) vi fu, a quanto pare, collocato più tardi dal nipote Tuthmosi III.
Due suoi figli sono raffigurati nella tomba di Paheri, sindaco di El-Kab, il cui padre è presentato come loro "aio" o "precettore". Sopra una stele spezzata, dell'anno quarto, Amenmose, forse il maggiore dei due fratelli, è descritto mentre caccia nel deserto presso la Grande Sfinge, e se è vero che allora era già generale dell'esercito di suo padre, questi doveva essersi sposato molto prima di salire sul trono. L'altro figlio, Wadjmose, è un personaggio misterioso e interessante, perché dopo la sua morte gli fu reso l'insolito onore di una cappelletta, eretta immediatamente a sud del Ramesseum.