Respirazione cellulare e consumo di ossigeno
Scopo
L'esperimento è stato condotto al Life Learning Center di Bologna (via delle Beverara 123).
Lo scopo è quello di osservare la respirazione cellulare mitocondriale, i fattori che la influenzano ovverosia ne aumentano la velocità o ne diminuiscono la velocità) e imparare ruolo e localizzazione di alcuni inibitori.
Materiali e strumenti.
In laboratorio saranno presenti:
    Strumenti
  • sistema multicelle termostato con agitazione magnetica (o camera ossigrafica);
  • elettrodo che misura la quantità di ossigeno in soluzione;
    Soluzioni
  • tampone di respirazione (saccarosio 0,25 M + HEPES 50 mM + MgSO4 4 mM + EDTA 0,5 mM + KH2PO4 10 mM + KOH fino a pH 7,4);
  • soluzione di glutamato e malato 6 mM;
  • soluzione di succinato 13 mM;
  • soluzione di ascorbato di magensio 9 mM con tetrametilfenilendiammina (o TMPD) 0,4 mM;
  • soluzione di ADP di magensio 180 mM;
  • soluzione di DNP 65 mM
  • soluzione di rotenone 1 μg/mL;
  • soluzione di antimicina A 1 μg/mL
  • soluzione di ciamuro di potassio 2mM;
  • soluzione di mitocondri 1 mg/mL (quelli preparati dal fegato di ratto si preparano freschi a partire da un omogenato fegato di ratto, centrifugato a 2000 giri/min per 4 min., il surnatante viene centrifugato nuovamente a 10000 giri/min per 10 min.)

Si procede su una camera ossigrafica 3 mL e si tara lo strumento. Per 3 mL si prevede uan quantità di ossigeno massima dispersa in soluzione (a 30°C) pari a 250 nM/mL ovvero 750 nM cmplessive.
Si disperdono i mitocondri con un pochi μ di tampone di respirazione al fine di lavorare con una concentrazione utile di 1 mg/mL di mitocondri.
Si stabilizza il segnale. Si aggiunge succinato in maniera da far lavorare la catena respiratoria con la sequenza:

complesso II, complesso III, complesso IV, ATPasi

Si genera così un gradiente protonico fino a saturazione completa di ATP.
La respirazione procede ma è abbastanza lenta, si aggiunge quindi ADP per aumentare il consumo di ossigeno. La respirazione procede fino a nuova saturazione in ATP.
Si inserisce quindi un disaccoppiante per esempio carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), che elimina il gradiente protonico e di potenziale tra le due parti della membrana mitocondriale annullando di fatto il blocco costituito dall'ATPasi.
Si osserva quindi che il consumo di ossigeno rinizia con velocità elevata fino a consumo totale dell'ossigeno presente nella soluzione.

In un esperimento successivo condotto con lo stesso sistema si inizia l'attività dei mitocondri con glutamato, malato e ADP in modo da far lavorare tutto il sistema della respirazione cellulare:

complesso I, complesso III, complesso IV, ATPasi
con una velocità più o meno costante.
Si aggiunge quindi DNP per disaccoppiare il consumo di ossigeno dall'ATPasi (fattore limitante), si osserva quindi un rapido aumento del consumo di ossigeno.
Addizionando rotenone si blocca il complesso I e quindi si osserva una diminuzione del consumo di ossigeno.
Aggiungendo poi succinato riparte la respirazione passando però dal complesso II come già ricordato in precedenza.
Operando ora con antimicina A si blocca il complesso III, bloccando nuovamente la respirazione.
Aggiungendo ascorbato riparte il consumo di ossigeno poiché l'ascorbato tramite il TMPD è in grado di ridurre direttamente il citocromo c facendo così lavorare il complesso IV che è quello poi direttamente coinvolto nel consumo di ossigeno.
Operando infine con cianuro si blocca anche quel'ultimo complesso e quindi si avrà un consumo di ossigeno quasi nullo.

Si riporta a completezza dei protocolli eseguiti un disegno schematico della catena respiratorio con la sequenza:

ATPasi, complesso I, complesso III, complesso II e complesso IV

Per vederlo con maggiori dettagli si consigli di aprire la fienstra pop-up seguente schema.

Bibliografia
Harold Hart "Chimica organica" II edizione Zanichelli 1985
Albert L. Lehninger "Biochimica" II edizione, 1987
Lubert Stryer "Biochimica" III edizione 1991