ECEFALOMIOPATIA MITOCONDRIALI

G.P.Comi, S.Messina, L.Chiversi.

Ist. di clinica Neurologica, Università degli studi Milano, Osp. Maggiore Milano IRCCS.

Tre sono i criteri fondamentali solitamente adottati per prevenire ad una diagnosi di mitocondriopatia: clinico-strumentale, morfologico, genetico.

INQUADRAMENTO CLINICO-STRUMENTALE

I disturbi clinici più comunemente accettati come suggestivi di malattia mitocondriale sono i seguenti:

oftalmoplegia estrinseca progressiva(CPEO),

ptosi palpebrale,

retinite pigmentosa,

miopatia artuale con intolleranza allo sforzo,

anomalie cardicache(difetti di conduzione o cardiomiopatia dilatativa),

epilessia,

episodi stroke-like,

ipoacusia neurosensoriale,

segni celebrali e/o extrapiramidali,

deficit cognitivo,

neuropatia periferica(più spesso assonale),

bassa statura,

diabete e disfunzioni endocrinologice in genere,

disturbi gastrointestinali.

Uno dei fenotipi clinici di più frequente riscontro, indipendentemente dalla mutazione genetica che lo sottende, è il cosiddetto “CPEO plus” ossia la presenza di CPEO associata ad uno o più disturbi tra quelli sopraccitati.

L’osservazione clinica deve per altro essere coadiuvata da una serie di indagini strumentali e di laboratorio atte a confermare il sospetto clinico e, una volta formulata la diagnosi, a monitorare nel tempo il decorso della malattia.

L’iter diagnostico comprende i seguenti parametri:

CPK sieriche, modicamente aumentato (tre-quattro volte i valori normali) nel 40% dei casi;

Acido lattico ematico a riposo e dopo sforzo fisico, spesso estremamente elevato causa la mancanza utilizzo di un  metabolismo di tipo aerobico;

studi elettrofisiologici: EMG, per la valutazione del danno neuromuscolare, EEG, che spesso evidenzia rallentamenti diffusi dell’attività celebrale o anomalie epilettiformi, ECG-EcoCG,da controllare a intervalli regolari dato l’elevato rischio di improvvisi peggioramenti(in modo tale da ricorrere all’impianto di pace-maker);

-Valutazione neurologica celebrale con TAC e/o RMN, allo scopo di individuare aree di alterato segnale, più spesso evidenti a livello della sostanza bianca biemisferica, dei nuclei della base, del cervelletto e del tronco encefalico-

-Valutazione neuro-oftalmoplegia e neuro-otologia.

INQUADRAMENTO MORFOLOGICO

Sulle biopsie muscolari viene effettuato uno studio istologico, istochimico ed immulologico. I due principali elementi diagnostici in senso mitocondriale sono la proliferazione dei mitocondri all’interno del tessuto muscolare (tali fibre sono chiamate “ragged-red” o RRF, per l’aspetto “stracciato” ed intensamente rossastro alla colorazione istologica tricromia di Gomori) e l’assenza o riduzione di cicrotromo e ossidasi (complesso IV della catena respiratoria, COX) in alcune fibra muscolari. La presenza di più mitocondri in una fibra costituisce in questi casi una condizione patologica perché, come vedremo (vedi “inquadramento genetico”), tali mitocondri contengono altissime percentuali di mtDNA mutato. Per la visualizzazione delle RRF il marker più specifico è la relazione istochimica per la succinico deidrogenasi (SDH, unico complesso della carena respiratoria a codificazione esclusivamente nucleare), con la quale le fibre ricche di mitocondri appaiono di colore blu intenso. Il deficit di COX si evidenzia utilizzando una reazione istochimica per l’enzima stesso ed osservando l’assenza di attività enzimatiche nelle fibre affette (appaiono di colore bianco anziché giallognolo). Oltre alle metodiche sopraccitate, si utilizza spesso anche un sistema di doppia reazione istochimica che consente di evidenziare contemporaneamente, ossia sulla stessa sezione di tessuto muscolare, tanto le RRF quanto il deficit di COX.

Collateralmente, qualora si rende necessario allo scopo di approfondire il sospetto diagnostico, si ricorre all’ausilio di metodiche di tipo immunoistochimiche, con anticorpi anti-DNA o anti subunità specifiche di complessi della catena respiratoria, o a studi di ibridizzazione in sito.

INQUADRAMENTO GENETICO

Si riscontrano mutazioni di tipo qualitativo e di tipo quantitativo del mrDNA. Nella prima categoria rientrano mutazioni puntiformi, delezioni o duplicazioni del mtDNA, della seconda fa parte la deplezione mtDNA, ossia la riduzione della quota di genomi mitocondriali normali (wild-type) nei tessuti. La diagnosi genetica si rende indispensabile in quanto ciascuna mutazione del mtDNA si associa a un diverso tipo di trasmissione ereditaria e consente pertanto di attuare programmi di prevenzione della malattia. Alcune malattie sono trasmesse per via patrilineare(mutazioni puntiformi), altre sono quasi esclusivamente sporadiche (delezioni singole), altre ancora seguono le leggi mendeliana o ereditarietà autosomica dominante (delezione multipla) o recessiva (deplezioni, delezioni multiple). Per una corretta diagnosi genetica è necessario disporre di DNA estratto dal tessuto muscolare scheletrico, in quanto determinate alterazioni (delezioni singole o multiple) non sono individuabili nel DNA di provenienza leucocitaria (le mutazioni puntiformi sono le uniche visibili anche a livello ematico).  Le metodiche di routine comprendono indagini con Southern blot, per individuare delezioni singole o multiple, nonché deplezioni, del mtDNA (in quest’ultimo caso è necessario impiegare due sonde, per il DNA mitocondriale e per quello nucleare), con enzimi di restrizione, per le ricerche di mutazione puntiforme patologiche tipiche, e con analisi heteroduplex, impiegata per lo screening dei precedenti accertamenti. Segue poi un analisi di sequenza genica dei tratti di mtDNA patologici.

Il valore patogenetico di qualsiasi difetto relativo del mtDNA è dato in primo luogo dalla condizione di eteroplasmia del difetto stesso, cioè dalla coesistenza, all’interno dello stesso tessuto o organo, di genomi mitocondriali mutati accanto ad altri normali (wild-type), ed in secondo luogo dalla dimostrazione che i genomi mitocondriali mutati segregano nelle fibre fenotipicamente affette (price di COX, RRF). Per verificare questa seconda condizione, oltre che della sopraccitata metodica della ibridizzazione in situ, anche di tecniche quali la PCR della singola fibra muscolare, in grado di individuare la quota di mtDNA mutato presente in singole fibre muscolari fenotipicamente normali o patologiche.

CLASSIFICAZIONE CLINICO-GENETICA

Nell’ambito delle malattie mitocondriali sono note alcune sindromi in cui una determinata mutazione genetica tende a associarsi ad un fenotipo clinico ben definito.

Elenco delle più note:

MUTAZIONI PUNTIFORMI

a)Mutazioni puntiformi situate in geni codificati tRNA

- Epilessia mioclonica con fibre Regged Red (MERRF)

Questo grave disordine neuromuscolare comprende epilessia, atassia progressiva., ipostenia ed ipotrofia muscolare, sordità e demenza.

Fallace et al. Hanno riscontrato una correlazione positiva tra gravità della sintomatologia, ridotta attività del complesso I e IV della catena respiratoria e difetti del metabolismo aerobico negli appartenenti in linea materna ad una famiglia MERRF. Geneticamente la malattia è legata alla presenza di una transizione A>G nel gene per il tRNA-Lys, nucleotide 8344 o, come recentemente descritto, in una transizione T>C al nucleotide 8356, situato nel medesimo gene.

- Encefalomiopatia mitocondriale, acidosi lattica ed episodi tipo stroke (MELAS o MALAS)

Gli individui affetti da questa sindrome mostrano un fenotipo caratterizzato da difetti di crescita, acidosi lattica persistente, episodi di vomito, crisi e ripetuti insulti celebrali, questi ultimi responsabili della presenza di emiparesi, emianopsia o cecità corticale.  Cefalee, ipoacusia e demenza sono altre caratteristiche abbastanza tipiche.

Due possibili mutazioni puntiformi, entrambe eteroplasmiche e situate nel gene per il tRNA-Leu (UUR), si associano alla presenza do questo disordine di ereditarietà materna: trasmissione A<G al nucleotide 3243 e trasmissione T<C al nucleotide 3271.

b)Mutazioni puntiformi situate in geni che codificano subunità proteiche degli enzimi mitocondriali.

- Atrofia ottica di Leber (LHON)

Questa rara malattia ad ereditarietà materna colpisce generalmente i giovani adulti.

Clinicamente è caratterizzata dalla progressiva perdita della visione centrale bilaterale talora accompagnata da microangiopatia pericapillare e da disturbi della conduzione cardiaca.

Dal punto di vista genetico si associa alla presenza di mutazioni puntiformi a carico del geni che codificano subunità proteiche degli enzimi mitocondriali.

- Neuropatia, Atassia e Retinite Pigmentosa (NARP)

Retinite pigmentosa, cecità, atassia, crisi epilettiche, neuropatia sensitiva, ipostenia progressiva di natura neurogena e demenza caratterizzano questa rara patologia ad ereditarietà materna, geneticamente associata alla presenza di una mutazione puntiforme eteroplasmica nel gene per la subunità 6 del complesso V (ATPase 6).

Si tratta di una trasmissione T>G al nucleotide 8993 del gene per l’ATPasi 6. la stessa mutazione è stata descritta in pazienti affetti da malattia di Leigh.

DELEZIONI SPORADICHE

Le patologie appartenenti a questa categoria differiscono l’una dall’altra dal punto di vista fenotipico, ma sono caratterizzate da una base genetico-molecolare comune, del mtDNA.

Quasi sempre si tratta di casi sporadici.

La lunghezza e la sede delle delezioni differiscono da paziente e paziente e non sembra essere correlata alla gravità del fenotipo clinico. Di tutte le delezioni, quella che più spesso si riscontra, indipendentemente dal fenotipo, misura 4977 paia di basi (bp) e viene comunemente indicata come “cammon deletion”.

- Sindrome di Kearns-Sayre (KSS)

La diagnosi di KSS si basa sul riscontro di esordio prima dei 20 anni, oftalmoplegia estrinseca progressiva (PEO) e retinite pigmentosa, invariabilmente associati a uno o più dei seguenti segni: difetto di conduzione cardiaca, sindrome celebrale, elevato contenuto proteiconel liquido cerebrospinale (> 100 mg/dl).

Di comune riscontro sono anche ritardo mentale, ipoacusia e disturbi endocrini (tra cui la bassa statura).

- Miopatia oculare pura (OM)

I pazienti OM presentano ptosi bilaterale simmetrica, generalmente senza diplopia, e PEO a partire dall’infanzia o dall’adolescenza. Pressoché tutti i casi di OM associati a delezioni del mtDNA (cisca il 50%) hanno familiarità negativa e presentano RRF all’esame del tessuto muscolare.

- Sindrome di Pearson

Si tratta di un disordine dell’infanzia, di solito fatale, che colpisce i tessuti emopoietici, il pancreas esocrino, il fegato e i reni. Il quadro più tipico è quello di una anemia macrocitica, accompagnata da neuropenia e trombocitopenia (pancitopenia), cui si associano acidosi lattica, fibrosi pancreatica ed atrofia splenica.

È stato descritto un difetto del complesso I della catena respiratoria specifico dei linfociti.

Le delezioni del mtDNA in pazienti affetti da sindrome di Pearson sono presenti in proporzioni elevata nel midollo spinale e nel pancreas.

DELEZIONI MULTIPLE

Questo tipo di disordine si associa all’interruzione della complementazione nucleo-mitocondrio, che controlla la duplicazione del mtDMA.

- Delezione multipla ed ereditarietà autosomica dominante

Clinicamente i pazienti presentano PEO, ipostenia e atrofia dei muscoli prossimali, ipoacusia neurosensoriale, cataratta e neuropatia periferica. L’esame di sezioni criostatiche di tessuto muscolare rivela la presenza di RRF, ridotta attività COX e segni neurogeni.

Biochimicamente si osserva una riduzione di circa il 50% dell’attività dei complessi I e IV della catena respiratoria.  Delezioni multiple del mtDNA sono individuabili tramite Southern Blot. La maggior parte delle delezioni è situata in una regione del mtDNA compresa tra la fine della D-loop ed il tratto corrispondente ai geni per l’ATPasi 6 e 8.

- Delezioni multiple ad ereditarietà autosomica recessiva.

Yuzaki et al. Hanno trovato delezioni multiple del mtDNA in famiglia giapponese fenotipicamente molto simile ai casi di delezione multiple sopraccitati.

Le delezioni, circondate da sequenze ripetute, sono distribuite casualmente lungo il genoma mitocondriale, con relativo risparmio della regione D-loop.

Un eredità tipo autosomica recessivo è suggerita dal fatto che i due fratelli affetti erano figli di genitori sani consanguinei.

DEPLEZIONE DI DNA MITOCONDRIALE

Questa anomalia del mtDNA, scoperta di recente, ha una espressione fenotipica variabile ed è solitamente letale nei primi mesi di vita.

Il tipo di ereditarietà evidenziato dallo studio di una famiglia suggerisce che il difetto primario risiede nel mtDNA; tuttavia, non è escluso che la riduzione dei livelli di mtDNA per se abbia un ruolo determinante nello sviluppo delle manifestazioni cliniche.

- Miopatia mitocondriale infantile fatale associata a deplezione del mtDNA

Marcata ipotonia muscolare, ptosi, oftalmoplegia, ed elevati livelli di lattato sierico sono le caratteristiche cliniche fondamentali di questa malattia che solitamente esordisce nei primi mesi di vita ed ha una trasmissione di tipo autosomica recessivo. L’esame della biopsia muscolare rivela la presenza di RRF e , a livello ultrastrutturale, di mitocondri abnormi. Biochimicamente è presente un deficit di citocromo b ed aa3 nel tessuto muscolare.

Studi combinati di immunoistichimica e genetica molecolare hanno rivelato livelli bassissimi di mtDNA nel tessuto muscolare di questi pazienti e lo stesso riscontro si è avuto studiando il tessuto renale di due pazienti che, oltre alla miopatia, presentavano disfunzioni renale gravi (sindrome di Franconi-De Toni-Dbrè).

- Epatopatia mitocondriale infantile fatale associata a delezione del mtDNA.

Tutt’oggi esiste un solo caso documentato di epatopatia mitocondriale associata a deplezione del mtDNA, ma similità di tipo clinico, morfologico suggeriscono l’esistenza di almeno un altro caso.  Il caso originale era la seconda cugina di una paziente con miopatia associata a deplezione del mtDNA (vedi sopra). All’età di cinque anni la paziente incominciò a manifestare vomito, diarrea e calo di peso. Indagini di laboratorio rivelano la presenza di enormi mitocondri di forma arrotondata stipati negli epatociti, nonché l’assenza di citocromo b ed aa3 nel fegato.

Nel frattempo, l’attività COX era circa il 10% del normale ed il livello di mtDNA circa il 13% del normale.

RECENTI ACQUISIZIONI

Per quanto resti sostanzialmente confermata la validità delle associazioni genotipo-fenotipo sopra descritte, l’esperienza degli ultimi anni, ci impone di ampliare lo spettro clinico e genetico delle diverse mitocondriopatie. Lo stesso fenotipo clinico, infatti, può essere sotteso da mutazioni genetiche diverse e, allo stesso modo, difetti biomolecolari spesso considerati in associazione ad un quadro clinico ben definito possono in realtà dare luogo a manifestazioni cliniche alquanto diverse, anche nell’ambito della stessa famiglia.

La nostra casistica, per esempio, consta di 207 pazienti (95 M e 112 F) considerati affetti da malattia mitocondriale in base ai criteri clinici e morfologici sopra descritti. In 159 di essi la diagnosi è stata confermata dal riscontro di un’alterazione genetica del mtDNA, mentre in 48 dei casi le metodiche di indagini bio-molecolare sopraccitate hanno dato finora esito negativo.

I 159 pazienti con diagnosi genetica sono così suddivisi:

70 delezioni singole, 51 delezioni multiple, 18 mutazioni puntiformi 3243, 15 mutazioni puntiformi 8344, 1 mutazione puntiforme 3260, 1 mutazione puntiforme 4309, 1 microdelezione di 5 paia di basi del gene codificato sulla subanità COX I, 2 delezioni infantili del mtDNA.

Dal punto di vista clinico è presente, nei nostri pazienti, una notevole variabilità clinica nell’ambito delle diverse categorie genetiche. Ad esempio, solo 9 dei 18 pazienti con mutazione puntiforme 3243 hanno un fenotipo MELAS, gli altri sono clinicamente CPEO plus. Lo stesso vale per i casi di mutazione puntiforme 8344, tutti appartenenti a 3 nuclei familiari: a 3 pazienti è presente il fenotipo MERRF, negli altri si va da un disturbo puramente psichiatrico (psicosi) ad un quadro CPEO plus.

La nostra casistica comprende inoltre alcuni quadri clinici atipici quali 1 caso di malattia demielizzante e 1 di emicrania associati a macrodelezione del mtDNA, 1 caso di paralisi periodica ipocaliemica s delezioni multiple del mtDNA, ed 1 forma di malattia del motoneurone giovanile a prevalente coinvolgimento del primo motoneurone nell’unico paziente con microdelezione del mtDNA.

Una attenta valutazione del dato clinico-anamnestico diviene pertanto indispensabile per indirizzare correttamente l’iter biomolecolare, prevenire il più rapidamente possibile ad una diagnosi ed, in ultima analisi, impostare un discorso in senso preventivo-diagnostico con il paziente.

 Articolo tratto da Atti del convegno "Aggiornamento sulle malattie muscolari" UILDM di Rimini, (Unione Italiana Lotta alla Distrofia Muscolare) http://www.uildm.org