AMMINOACIDI

Gli aminoacidi più comuni che costituiscono le proteine sono tutti a-amminoacidi corrispondenti alla formula generale:

In quasi tutti gli a-amminoacidi naturali la configurazione dell’atomo di carbonio a, asimmetrico, è L (ponendo il gruppo carbossilico in alto), cioè è legato al gruppo amminico alla sua sinistra. Fa eccezione la glicina, che è l’unico amminoacido achirale:

Gli a-amminoacidi possono essere classificati in 4 gruppi in base alla natura del gruppo R:

1) amminoacidi con gruppi R non polari;

2) amminoacidi con gruppi R polari neutri;

3) amminoacidi con gruppi R basici;

4) amminoacidi con gruppi R acidi.

1) Amminoacidi con gruppi R non polari

Fanno parte del primo gruppo la glicina, l’alanina, la fenialanina, la valina, la leucina, l’isoleucina, la prolina, il triptofano e la metionina. Es.:

2) Amminoacidi con gruppi R polari neutri

Fanno parte di questo gruppo la serina, la treonina, la tirosina, la cisteina, l’asparagina e la glutammica. Es.:

3) Amminoacidi con gruppi R basici

Fanno parte di questo gruppo l’arginina, la lisina e l’istidina. Es:

Di questi il più basico è l’arginina, a causa della stabilizzazione della carica positiva operata dal gruppo guanidinico, una volta che sia protonato:

4) Amminoacidi con gruppi R acidi

Fanno parte di questo gruppo due amminoacidi, l’acido aspartico e l’acido glutammico:

PROPRIETA’ ACIDE E BASICHE DEGLI AMMINOACIDI

Gli amminoacidi sono solidi cristallini solubili in acqua, con punti di fusione elevati, nonostante il peso molecolare molto grande. Tutte queste proprietà sono dovute al fatto che gli amminoacidi esistono prevalentemente nella forma dipolare o zwitterionica:

Gli amminoacidi hanno comportamento anfotero, poiché possono reagire sia come acidi, donando un protone, sia come basi, accettando un protone:

In ambiente nettamente acido gli amminoacidi esistono quindi in forma protonata come acido biprotico, in grado di donare due protoni a due equivalenti di base (vedi reazione sottostante). In una titolazione con una base, a partire da un ambiente acido, perciò, avvengono in sequenza i due trasferimenti di protoni:

L’aggiunta del primo equivalente di base B serve a neutralizzare il gruppo carbossilico (Ka ≈5∙10^-5). Si arriva così al primo punto equivalente della titolazione. Il secondo equivalente di base serve a neutralizzare il gruppo ammonio (Ka ≈2∙10^-10). Si arriva così al secondo punto equivalente della titolazione.

Come si vede dalla curva di titolazione, in ambiente acido (a pH = 0) l’amminoacido si trova forma di ione positivo e se viene posto in un campo elettrico esso migra verso il catodo (polo negativo). D’altra parte, in ambiente basico l’amminoacido si trova sotto forma di ione negativo, che migra verso l’anodo. Ad un dato valore del pH la molecola ha carica totale zero, per cui essa non si muove se viene posta in un campo elettrico; tale valore di pH viene chiamato punto isoelettrico.

Gli amminoacidi neutri (amminoacidi apolari e amminoacidi polari neutri) hanno punti isoelettrici leggermente inferiori a 7. Gli amminoacidi basici hanno punti isoelettrici maggiori di 7: essi infatti per esistere come molecola con carica elettrica 0 hanno bisogno di un eccesso di base per neutralizzare la forma protonata del secondo gruppo basico. Analogamente gli amminoacidi acidi hanno punti isoelettrici inferiori a 7 perché essi sono a carica 0 solo in presenza di acidi, che impediscono la dissociazione del secondo gruppo carbossilico.

DOSAGGIO DEGLI AMMINOACIDI

a) Metodo di Van Slyke.

Gli amminoacidi, come tutte le ammine primarie, reagiscono con acido nitroso, liberando una molecola di azoto per ogni gruppo amminico. L’azoto può venire raccolto e dalla sua quantità, determinata volumetricamente, si può risalire al numero di gruppi amminici presenti.

b) Reazione con la ninidrina.

PEPTIDI

Sono poliammidi le cui unità monomeriche sono costituiti da a-amminoacidi. I peptidi possono essere formati da due amminoacidi (dipeptidi), tre amminoacidi (tripeptidi), e così via. I peptici formati da un numero limitato di amminoacidi sono chiamati oligopeptidi, mentre sono chiamati polipeptidi quelli con peso molecolare elevato: le proteine sono polipeptidi con peso molecolare molto elevato, superiore a 10.000. Le strutture dei peptici vengono solitamente rappresentate scrivendo in successione le sigle degli amminoacidi, cominciando da quello in cui il gruppo amminico è libero, detto amminoacido N-terminale, e terminando con quello in cui è libero il gruppo carbossilico, amminoacido C-terminale.

La struttura delle proteine.

La conoscenza della struttura di una proteina si articola in tre, e talvolta quattro, livelli:

1) La struttura primaria: è data dalla sequenza degli amminoacidi che costituiscono la catena polipeptidica.

2) La struttura secondaria: è la disposizione regolare, spesso a spirale o a zig-zag, di una catena polipeptidica nello spazio soprattutto lungo una dimensione.

3) La struttura terziaria: è la disposizione tridimensionale che la spirale assume nello spazio ripiegandosi e avvolgendosi.

4) La struttura quaternaria: è la disposizione reciproca delle varie catene polipeptidiche nelle proteine costituite da due o più unità polipeptidiche.

La determinazione della struttura primaria dei peptidici

La determinazione della sequenza degli amminoacidi di una catena polipeptidica richiede una serie complessa di operazioni:

- il polipeptide viene purificato in modo che abbia una composizione chimica unitaria;

- Viene determinato il peso molecolare del polipeptide;

- Un campione del polipeptide viene sottoposto a idrolisi totale e la miscela di amminoacidi così ottenuta viene analizzata in modo da determinare la composizione in amminoacidi;

- Per determinare la sequenza degli amminoacidi della catena polipeptidica, si comincia col determinare quale è il primo amminoacido della catena, o amminoacido N-terminale, e quale è l’ultimo amminoacido, o amminoacido C-terminale.

- La catena polipeptidica viene scissa per blanda idrolisi chimica o enzimatica in frammenti oligopeptidici contenenti da due a cinque unità amminoacidiche. Questa scissione viene ripetuta con metodi diversi in modo che le rotture avvengano in punti della catena diversi dai precedenti.

- Si confrontano le diverse serie dei frammenti ottenuti per idrolisi: combinando i frammenti con unità comuni, si ottiene l’intera sequenza.

1) Determinazione dell’amminoacido N-terminale.

L’amminoacido N-terminale viene identificato sfruttando il fatto che il gruppo amminico è libero e non impegnato in legami ammidici. Uno dei metodi usati è il metodo di Ranger, basato sull’uso del reagente 2,4-dinitrofluorobenzene. Trattando un peptide con questo reagente si ha una reazione di sostituzione elettrofila aromatica in cui il gruppo amminico libero sostituisce il fluoro, con formazione di un 2,4-dinitrofenilamminoacido che può essere separato dagli altri amminoacidi ed identificato per confronto cromatografico con campioni noti di 2,4-dinitrofenilderivati degli amminoacidi.

Un altro reagente comunemente usato è il cloruro di 1-dimetilamminonaftalen-5-solfonile o dansile:

2) Determinazione dell’amminoacido C-terminale.

Con metodi chimici si può effettuare con

- l’idruro di litio e boro (LiBH₄). Viene ridotto solo il gruppo carbossilico terminale ad alcole primario, mentre i gruppi ammidici rimangono inalterati. Per successiva idrolisi del peptide si ottiene un amminoalcole corrispondente al residuo C-terminale, mentre tutte le altre unità vengono ottenute come amminoacidi liberi.

- il trattamento del peptide con idrazina (idrazinolisi) tutti i legami peptidici trasformando tutti gli amminoacidi in idracidi, tranne l’amminoacido C-terminale.

- L’uso dell’enzima carbossipeptidasi, che rimuove selettivamente l’amminoacido C-terminale.

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APPROFONDIMENTO:

CALCOLO DEL pH AL PUNTO ISOELETTRICO