Determinazione dell'attività antiossidante dell'acido ascorbico.

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Determinazione dell'attività antiossidante dell'acido ascorbico

(Aggiornato al 2 giugno 2001)

SCOPO DELL'ESPERIENZA

Esaminare le proprietà antiossidanti dell' ACIDO ASCORBICO attraverso l' utilizzo del metodo DMPD, rilevandone la concentrazione incognita in 1 grammo di omogenato di pomodoro.

MATERIALE ADOPERATO

Spettrofotometro, centrifuga, bilancia analitica, campione di pomodoro frullato, falcon, pipettatori automatici, provette, acqua deionizzata.

DESCRIZIONE DELL'ESERCITAZIONE

Gli antiossidanti sono sostanze che hanno la funzione di compensare l'effetto dei RADICALI LIBERI, molecole tipiche del METABOLISMO OSSIDATIVO altamente reattive, che provocano gravi danni perché tendono a stabilizzarsi reagendo con altre sostanze. Il metodo adoperato per lo scopo dell' esperienza è basato sull' utilizzo del cromogeno DMPD atto a simulare l'effetto di un RADICALE LIBERO attraverso una serie di colorazione dei campioni, disposti all' interno di provette, che vanno dal fucsia al bianco e che esprimono rispettivamente la minima e la massima concentrazione di acido ascorbico. Alla fine costruiremo la retta di taratura che ci permetterà di apprezzare la concentrazione dell'antiossidante nelle due estrazioni incognite.

Passiamo alla preparazione della I estrazione : pesare in una provetta 1 grammo di omogenato di pomodoro, aggiungere con pipettatori automatici 5 millilitri di acqua deionizzata e sottoporla a centrifugazione a 4000 giri per 5 minuti, estrarre il surnatante, ovvero la porzione superiore del campione non precipitato (con l'utilizzo del pipettatore) e trasferirlo in un'altra provetta.

Per la preparazione della II estrazione aggiungere al pellet, ovvero la porzione del campione precipitato, altri 5 millilitri di acqua deionizzata e sottoporla a centrifugazione a 4000 giri per 5 minuti, estrarre il surnatante e trasferirlo in un' altra provetta.

Successivamente prepariamo il cromogeno DMPD in soluzione 0,1 molare in ambiente acido utilizzando 10 millilitri di tampone acetato pH 5,25 ed in presenza di 0,05 molare dell'agente ossidante FeCl3 (cloruro ferrico). Per la preparazione della retta di taratura utilizziamo 10 provette di cui la prima è definito campione bianco, costituita solo dal cromogeno e dall'acqua, mentre le altre nove hanno una concentrazione di acido ascorbico di cui conosciamo la concentrazione, così composte:

2 ml di cromogeno + 200 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 10 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 190 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 20 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 180 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 40 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 160 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 50 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 150 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 100 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 100 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 150 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 50 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 200 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,04 mg/ml + 0 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 150 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,08 mg/ml + 50 microlitri di acqua deionizzata.
2 ml di cromogeno + 200 microlitri sol. di Ac. Asc. 0,08 mg/ml + 0 microlitri di acqua deionizzata.

Successivamente, passiamo all'utilizzo dello spettrofotometro, definito a doppio raggio per la presenza di due puvette alloggiate all'interno, avendo cura di azzerarle con l'aggiunta di acqua (leggendone l'assorbanza a 505 nanometri) in modo da creare una linea di partenza. Una di queste puvette resta alloggiata all'interno dello spettrofotometro mentre utilizziamo l'altra per leggere l'assorbanza (a 505 nanometri) dei 10 campioni standard più le nostre due estrazioni, tenendo presente che più l'acido ascorbico è concentrato meno il campione è colorato (quindi il campione bianco è completamente fucsia) e meno legge allo spettrofotometro. I dati ottenuti sono riportati di seguito:

Il primo campione definito campione bianco legge 0,712.
Il secondo campione legge 0,688. · Il terzo campione legge 0,675.
Il quarto campione legge 0,636.
Il quinto campione legge 0,619.
Il sesto campione legge 0,528.
Il settimo campione legge 0,437.
L'ottavo campione legge 0,341.
Il nono campione legge 0,169.
Il decimo campione legge 0,046.
La prima estrazione incognita legge 0,423.
La seconda estrazione incognita legge 0,658.

La prima estrazione incognita legge di meno perché c'è più acido ascorbico. Attraverso l'utilizzo di un sistema di assi cartesiani, dove sull'asse delle ascisse poniamo la concentrazione di acido ascorbico dei campioni standard e sull'asse delle ordinate la percentuale di inibizione, costruiamo la retta di taratura che ci permetterà, nota la percentuale di inibizione delle due estrazioni, di risalire graficamente alla concentrazione di acido ascorbico dei campioni incogniti (le due estrazioni) che sommate ci forniranno la concentrazione totale dell'antiossidante contenuto in 1 grammo di omogenato di pomodoro, scopo della nostra esperienza.

Il calcolo della percentuale di inibizione è dato dalla seguente formula:

[1-(Assorbanza campione / Assorbanza bianco)] x 100.

Il calcolo della concentrazione di acido ascorbico è dato dalla seguente formula:

Concentrazione di acido ascorbico * Volume di sol. utilizzato / 2200 microlitri (volume totale).

I valori ottenuti sono riportati di seguito:

% inibizione del campione bianco = 0; concentrazione di acido ascorbico = 0 mg/ml.
% inibizione del secondo campione = 3,37; concentrazione di acido ascorbico = 0,00018 mg/ml.
% inibizione del terzo campione = 5,20; concentrazione di acido ascorbico = 0,00036 mg/ml.
% inibizione del quarto campione = 10,67; concentrazione di acido ascorbico = 0,00073 mg/ml.
% inibizione del quinto campione = 13,06; concentrazione di acido ascorbico = 0,00091 mg/ml.
% inibizione del sesto campione = 25,84; concentrazione di acido ascorbico = 0,00182 mg/ml.
% inibizione del settimo campione = 38,62; concentrazione di acido ascorbico = 0,00273 mg/ml.
% inibizione dell' ottavo campione = 52,11; concentrazione di acido ascorbico = 0,00364 mg/ml.
% inibizione del nono campione = 76,26; concentrazione di acido ascorbico = 0,00545 mg/ml.
% inibizione del decimo campione = 93,54; concentrazione di acido ascorbico = 0,00728 mg/ml.
% inibizione della prima estrazione incognita = 40,59.
% inibizione della seconda estrazione incognita = 7,58.

Riportiamo i dati ottenuti sul grafico:

CALCOLO DEL DATO FINALE

Esaminando il grafico si evince che:

la concentrazione della prima estrazione si avvicina a 0,0030 mg/ml.
la concentrazione della seconda estrazione si avvicina a 0,00053 mg/ml.

Il dato finale si ottiene sommando (0,0030 + 0,00053)mg/ml = 0,00353 mg/ml, che è la concentrazione in 1 grammo di omogenato di pomodoro.