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Determinazione e purificazione delle proteine da latte intero

(Aggiornato al 2 maggio 2001)

SCOPO DELL'ESPERIENZA

Determinazione e purificazione di proteine del latte intero attraverso l'uso della CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO.

MATERIALE ADOPERATO

Campione di latte centrifugato, centrifuga, tubo da dialisi, colonna cromatografia a scambio ionico, resina DEAE SEPHAROSE, spettrofotometro, acqua deionizzata, provette.

DESCRIZIONE DELL'ESERCITAZIONE

Il latte è un alimento completo, infatti è costituito da acqua, zuccheri, lipidi, minerali, vitamine, e da due grandi famiglie di proteine che sono le CASEINE e le SIEROPROTEINE. Le caseine rappresentano la componente più abbondante. Il metodo di separazione adoperato per lo scopo dell'esperienza è basato sull'uso della colonna cromotografica a scambio ionico, una tecnica di migrazione differenziale che ci permetterà di separare le proteine del latte. Infine utilizzeremo lo spettrofotometro per costruire la retta di taratura che ci permetterà di quantificare la separazione.

Passiamo ora alla preparazione del campione: preleviamo 5 ml di latte e centrifughiamolo per 10' a 4000 rpm, in modo che le particelle di materia grassa, le più leggere, salgano in superficie dando origine alla crema di latte. La crema di latte in superficie la elimineremo attraverso la filtrazione su un batuffolo di ovatta. Aggiungiamo, goccia a goccia, 0.5 ml di acido acetico al 10%, per far precipitare le caseine, e agitiamo bene. Dopo 10' aggiungiamo 0,5 ml di acetato di sodio 1M, e centrifughiamo per 15' a 5000 rpm. Le caseine precipitate nel fondo del pellet verranno sciolte in 5 ml di urea 9M e le metteremo a -20°C. Recuperiamo il supernatante, ovvero la porzione superiore del campione non prelevato, e precipitiamo le proteine solubili, le sieroproteine, aggiungendo un sale, il solfato di ammonio al 50%. Quando il sale si è sciolto centrifughiamo per 10' a 4000 rpm. Scartiamo il supernatante e risospendiamo il pellet in 5 ml di tampone fosfato 20 mM a pH 7.2. Mettiamo il tutto in un TUBO DA DIALISI (una membrana semipermeabile che presenta una porosità pari a 12000-14000 dalton) per tutta la notte contro tampone fosfato 20 mM a pH 7.2. Questo procedimento ci serve per allontanare il sale e dializzare le sieroproteine. La dialisi è una metodologia necessaria affinchè si possa purificare il nostro campione. Praticamente si tratta di una sorta di "sacchetto", costituito da una membrana semipermeabile, e all'interno di questo si pone il nostro campione. Il tubo da dialisi viene immerso in acqua distillata, la quale può essere più volte sostituita. Così facendo si avrà la dispersione (cioè la fuoriuscita dal tubo da dialisi) di molecole quali ad esempio i sali che avevamo aggiunto. Non potranno però passare grandi molecole come le sieroproteine, che quindi restano all'interno. La preparazione del tubo da dialisi consiste nel bollirlo per 10' e poi, una volta raffreddato, conservalo in acqua distillata. È importante che questa fase del processo venga fatta con assoluta cura, magari adoperando guanti in gomma: la delicatezza della membrana è elevata ed un eventuale danneggiamento potrebbe compromettere tutto il lavoro fin qui fatto.

Prepariamo ora la COLONNA CROMATROGRAFICA. Iniziamo con il dire che il principio su cui si basa la cromatografia è l'attrazione che si genera tra molecole cariche con segno opposto. Le proteine possiedono gruppi ionizzabili, con carica netta, positiva o negativa. La presenza di tali cariche è sfruttata nelle procedure di separazione di miscele che le contengono. La separazione che attuiamo è condotta in una colonna impacchettata da una resina (2 ml) di scambiatori anionici deboli, detta DEAE (Dietildenomminoetil) SEPHAROSE. Questo scambiatore possiede gruppi carichi positivamente che attraggono le molecole cariche negativamente. Usiamo, quindi, lo scambiatore debole perché possiede un pH di ionizzazione al quale le proteine sono stabili. La resina è in 10% di etanolo, va pertanto prima lavata in acqua e poi con il tampone fosfato 20 mM, usato durante la fase di preparazione del campione. Quindi preleviamo 5 ml della resina in 10% di etanolo, dopo averla agitata bene. Centrifughiamo per 30'' a 2000 rpm. Scartiamo il supernatante e risospendiamo la resina in 5 ml di acqua deionizzata. Ripetiamo la centrifugazione e il lavaggio usando sempre il tampone fosfato 20 mM. Versiamo la resina nella colonna, senza far formare bolle d'aria, e inoltre assicuriamoci che al di sopra del letto della colonna ci sia sempre il tampone. Facciamo passare attraverso la colonna almeno 10 ml di tampone (5 volte il volume del letto della colonna), per ottenere una colonna equilibrata, pronta a separare il nostro campione. Passiamo alla preparazione del campione e alla cromatografia. Preleviamo il campione dializzato e misuriamone il volume. Se il campione dovesse presentare corpi galleggianti o non dovesse esser perfettamente limpido, lo centrifugheremo a 2000g per 5', altrimenti provocheremo l'intasamento della colonna e un drastico aumento dei tempi cromatografici. Lasciamo che il livello del tampone sopra il letto della colonna scenda il più possibile (meno di 1mm), e carichiamo il nostro campione tenendone circa 1 ml come controllo. A questo punto cominciamo a raccogliere frazioni di circa 1,5 ml all'uscita dalla colonna. Quando tutto il campione è passato, riaggiungiamo il tampone 20 mM e continuiamo a passarlo attraverso la colonna per fluire tutte le proteine che non si legano alla fase fissa (solida). Per valutare fino a quando dobbiamo lavare la colonna con il tampone basta leggere allo SPETTROFOTOMETRO l'assorbimento a 280 nm. Quando questo avrà raggiunto un valore costante, possiamo eludere le proteine legate specificamente alla resina , aggiungendo al tampone fosfato 20 mM pH 7.2 il NaCl 0,5 M. Gli ioni cloro sono in grado con il loro avanzamento di spostare le proteine. Attraverso l'analisi spettrofotometrica riusciremo dunque a quantificare la separazione delle proteine, valutando i diversi picchi di assorbimento: