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considerazioni anatomiche nelle meningiti batteriche
patogenesi delle meningiti batteriche
modificazioni nella composizione cellulare chimica del liquor durante meningite batterica
raccolta, trasporto e ricezione del liquor
diagnosi di laboratorio della meningite batterica
metodi per la determinazione degli Ag. batterici
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Innanzitutto una piccola premessa, questa parte del nostro sito ha il solo scopo di mettere a disposizione di altri il materiale raccolto in occasione della stesura della mia tesi da diverse fonti, e a causa della vastità dell'argomento di ogni paragrafo si è voluto fare un riassunto ridotto al minimo essenziale. I risultati sono stati ottenuti da una ricerca fatta su materiale proveniente dagli Ospedali Civili Riuniti di Brescia. Un ringraziamento particolare ai medici e ai tecnici che mi hanno aiutato.
La meningite è definita come un'infiammazione delle meningi che si caratterizza per un numero abnorme di globuli bianchi nel liquido cerebrospinale. La sindrome meningitica può essere causata da un'ampia varietà di agenti infettivi ed essere anche una manifestazione di malattie non infettive. La meningite batterica è l'infezione più comune e rilevante del Sistema Nervoso Centrale, che può progredire rapidamente e portare a morte o debilitazione permanente, per questo motivo tale infezione provoca giustificabili risposte emotive molto forti e intervento medico immediato, tanto che la diagnosi è la vera forse unica urgenza in Microbiologia. A seconda del decorso può essere: FULMINANTE: con evoluzione rapida in coma e stato di shock quasi sempre irreversibile ACUTA: esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni SUBACUTA: decorso lento e insidioso, più prolungato con segni meningei sfumati che talora non richiamano l'attenzione del medico (solitamente causata da bacillo tubercolare oppure da miceti). RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione generalmente di un difetto dell'ospite, o dell'anatomia locale oppure delle difese antibatteriche immunologiche (es: trauma cranico, pazienti HIV+, ecc). DECAPITATA: forma il cui decorso è attenuato per il precoce intervento con terapia antibiotica. Per esempio la N. meningitidis è molto sensibile agli antibiotici per cui la sintomatologia è attenuata ed è alta la frequenza di falsi negativi nelle indagini colturali del microorganismo. L’avvento e l’uso diffuso degli antibiotici nel trattamento delle meningiti ha ridotto drasticamente la mortalità dovuta a questa malattia. Ciò nonostante, sia la morbilità (da 0.2 a 6 casi per 100.000 all’anno) e la mortalità (da 3 a 33%) delle meningiti batteriche non trattate o trattate in modo inappropriato rimangono alte negli Stati Uniti. La meningite batterica rappresenta un problema importante anche in pazienti ospedalizzati. Nei grossi ospedali urbani di cura terziaria la distribuzione della eziologia batterica della meningite nell’adulto differisce da quella degli ospedali di comunità più piccole dove predominano le malattie acquisite in comunità. Ad esempio nel Massachusset General Hospital circa il 40% di meningite negli adulti era di origine nosocomiale (in prevalenza gram-negativi 40%più vari streptococchi, 10% Stafilococco aureus e stafilococchi coagulasi negativi). Risulta inoltre che il 40% di questi episodi furono associati ad una alta mortalità (il 35% per un unico episodio di meningite nosocomiale). Le meningiti batteriche sono molto più comuni nei Paesi in via di sviluppo che negli Stati Uniti. Per esempio, la morbilità in Brasile e in alcune parti dell’Africa è di 300-400 casi per 100.000 durante epidemie. Negli ultimi 25 anni si sono verificate variazioni importanti nella frequenza dei diversi tipi di agenti eziologici di tale malattia.La meningite bacillare da gram-negativi si è raddoppiata in frequenza negli adulti, riflettendo le procedure neurochirurgiche più frequenti ed estese come pure altri fattori nosocomiali. La Listeria monocytogenes è aumentata di 8-10 volte come causa di meningite negli ospedali generali cittadini, riflettendo l’aumento della popolazione di immuno-depressi a rischio particolare. Infatti le infezioni da Listeria sembrano derivate dall’assunzione di particolari alimenti (prodotti caseari, vegetali non cotti,...) e coinvolgono soprattutto i riceventi di trapianti d’organo, pazienti in unità di emodialisi, pazienti in trattamento con steroidi e farmaci citotossici, pazienti con malattie epatiche e HIV positivi, donne in gravidanza e neonati. La maggior parte dei pazienti con meningite batterica sopravvive, ma postumi neurologici sopraggiungono in quasi 1/3 di tutti i sopravvissuti (soprattutto neonati e bambini). L’esordio della malattia, almeno nelle forme purulente, è improvviso, con brividi, febbre elevata, malessere ingravescente, cefalea ed eventualmente vomito. I sensi risultano spesso compromessi e si possono manifestare precocemente segni di torpore. NELLE MENINGITI BATTERICHE
La meningite è una infiammazione delle meningi (Pia Madre, Aracnoide e Dura Madre), tre sottili membrane che rivestono intimamente l’Encefalo e il Midollo spinale. In particolare, la meningite nasce all’interno dello spazio subaracnoideo, che si trova tra la media e la più interna delle lamine: l’Aracnoide e la Pia Madre. Le meningi delimitano con il rachide tre spazi siti di infezioni batteriche distinte: lo spazio epidurale tra la vertebra e la Dura Madre, lo spazio subdurale tra la Dura Madre e l’Aracnoide, e lo spazio subaracnoidale tra l’Aracnoide e la Pia Madre che è la sede specifica dell’esordio della meningite. I villi estremamente vascolarizzati della Pia Madre si proiettano in 4 ventricoli all’interno dell’Encefalo e sono rivestiti da cellule epiteliali ependimali. Queste proiezioni sono conosciute come Plessi coronoidei e sono i siti nei quali la componente fluida del sangue è modificata attraverso secrezione e assorbimento di certi soluti e convogliata all’interno dei ventricoli sotto forma di liquido cefalorachidiano o liquor. Il liquor circola nei ventricoli e nello spazio subaracnoidale, attorno all’Encefalo e alla Corda spinale e ritorna al sistema circolatorio sanguigno attraverso i villi subaracnoidali che proiettano nel Seno Sagittale Superiore nella volta interna del cranio. Negli adulti viene prodotto da 400 a 600 ml di liquor che ricircola ogni giorno. Il normale volume di liquor è tra i 40 e i 60 ml nei neonati e i 100 e i 160 ml negli adulti.
PATOGENESI DELLE MENINGITI BATTERICHE
Ci si può trovare nella condizione in cui non è dimostrabile un processo infettivo localizzato o a distanza dalle meningi, cui attribuire la responsabilità primaria della infezione (non c’è concomitante batteriemia o viremia sistemica). Oppure è evidenziabile una estensione secondaria di una infezione contigua parameningea (otite, mastoidite, ...) o in alternativa, la localizzazione "metastatica", tramite il torrente circolatorio, di una qualsiasi altra infezione (endocardite, pleuropolmonite, nefrite, ecc.). I batteri quindi possono raggiungere le meningi attraverso varie vie: a) Batteriemia sistemica (la più frequente). b) Ingresso diretto dal tratto respiratorio superiore o dalla cute attraverso un difetto anatomico (frattura cranica, meningocele, ...). c) Passaggio intracranico attraverso una venula dal nasofaringe (l’adesione faringea è favorita come nel caso dello Str. pneumoniae dalla capacità di produrre proteasi delle IgA; oppure endocitosi come nel caso dei meningococchi; oppure per via intercellulare con separazione delle giunzioni serrate apicali tra le cellule epiteliali colonnari come nel caso dell’H.influenzae). d) Diffusione da focus contiguo di infezione (infezione dei seni paranasali, trasudazione da un ascesso cerebrale, ...).
COLONIZZAZIONE E ATTACCO
Alcuni batteri che provocano meningiti hanno "pili" (organi specifici per l’adesione), che permettono loro di attaccarsi a specifiche cellule mucose e, successivamente, di colonizzare la superficie mucosa del nasofaringe. La distribuzione di specifici recettori di cellule mucose e epiteliali probabilmente determina i siti della colonizzazione, fatto comprovato per quanto riguarda l’H.influenzae e la N. meningitidis.
PASSAGGIO DELLE BARRIERE MUCOSE
La porta di entrata per i batteri in grado di provocare meningiti, e i meccanismi attraverso i quali è ottenuta, non sono ben conosciuti. L’ingresso è probabilmente costituito da siti attraverso cui i batteri, attivamente (mediante invasione diretta con o senza danneggiamento della cellula ospite) o passivamente (attraverso fagocitosi) penetrano i tessuti subepiteliali e successivamente entrano nel circolo ematico. E’ noto per esempio che la N. meningitidis viene fagocitata dalle cellule epiteliali del nasofaringe.
ENTRATA NEL LIQUIDO CEFALORACHIDIANO
Mentre sono nel circolo ematico, i batteri che causano meningite devono evitare di essere fagocitati dai leucociti polimorfonucleati e dalle cellule reticoloendoteliali e devono evitare di essere lisati dal complemento e dagli anticorpi specifici. Una volta evitato l’attacco, i batteri si riversano nello spazio subaracnoidale e, quindi, nel liquor. Le vie di ingresso preferenziali verso questo spazio sono aree di resistenza minima come i plessi coronoidei, i seni venosi durali, la lamina cribrosa, i capillari cerebrali, siti di ferite chirurgiche, traumatiche o congenite del Sistema Nervoso Centrale o siti di infezione parameninge (es.: ascesso epidurale).
Lo spazio subaracnoidale e il suo liquor sono relativamente senza difese nel fermare l’invasione di batteri patogeni a causa della povertà nel liquor di cellule fagocitanti e basse concentrazioni del complemento e di immunoglobuline. Un invasione a moltiplicazione incontrollata di batteri nel liquor porta a meningite. L’infiammazione delle meningi prende origine dalla presenza del lipopolisaccaride batterico, che pare conferisca qualche particolare tropismo meningeo probabilmente mediante recettori di superficie. Gli antigeni batterici stimolano i monociti a produrre la citochina "Interleuchina 1" e stimolano i macrofagi, gli astrociti, cellule della microglia, cellule ependimali e cellule endoteliali nel Sistema Nervoso Centrale a produrre la citochina "Tumor Necrosis Factor" (o cachectina). Il TNF e l’IL-1 probabilmente agiscono sinergicamente per provocare le risposte infiammatorie che si manifestano clinicamente come meningite. AGENTI EZIOLOGICI DELLE MENINGITI BATTERICHE Le più comuni meningiti batteriche purulente possono avere come agenti causali:
Agli inizi degli anni ’80, l’Haemophilus fu isolato nel 45-48% di tutti i casi di meningite batterica negli Stati Uniti; la mortalità complessiva è del 3-6%. La maggior parte dei casi fu osservata in neonati ed in bambini sotto i 6 anni, ed in più del 90% dei casi era presente il ceppo capsulato tipo B. Il batterio viene in contatto con la mucosa nasofaringea, da lì tramite i vasi sanguigni giunge al S.N.C. e nel liquor si replica provocando l’infiammazione. La meningite da Haemofilus si manifesta di norma 3-4 giorni dopo un raffreddore apparentemente banale, un’otite o un’infezione respiratoria. I neonati presentano sonnolenza, vomito, convulsioni (non sempre nel caso di periodi febbrili) ed un pianto stridente, oltre a cefalea e fotofobia. La meningite può avere esito fatale e nel 9-15% dei sopravvissuti provoca una diminuzione della capacità uditiva (ipoacusia). Possono presentarsi, anche se in una percentuale più bassa, alterazioni della visione. Bambini colpiti da gravi forme di meningite possono manifestare nel corso del tempo convulsioni e più raramente epilessia. L’isolamento di questo microorganismo in bambini più grandi e in adulti potrebbe far pensare alla presenza di alcune condizioni patologiche latenti come sinusiti, otite media, polmonite, diabete, alcolismo, splenectomia o asplenismo, trauma cranico con fuoriuscita di liquido cerebrospinale ed immunodeficienza ipogammaglobulinemia. Da poco tempo l’incidenza delle infezioni invasive, specie nei bambini piccoli, è risultata ridotta per l’utilizzazione più recente del vaccino coniugato anti H. influenzae tipo B in cui il polisaccaride della capsula batterica è stato coniugato al tossoide del tetano o ad un derivato della tossina della difterite: CRM 197, che è stato autorizzato per uso routinario in tutti i bambini da 2 mesi a 5-6 anni.
La N. meningitidis molto spesso provoca meningite nei bambini e nei giovani e viene isolata negli Stati Uniti nel 14-20% dei casi di meningite batterica, con una mortalità complessiva del 10-13%. Il sierotipo B ha un’incidenza fra i ceppi del 51% e normalmente causa episodi sporadici. La malattia sostenuta dai sierogruppi A e C è presente durante le epidemie, mentre il tipo Y si può associare a polmonite. Pazienti con carenze dei fattori terminali del complemento (C5, C6, C7, C8 e talvolta C9), che costituiscono il cosiddetto complesso di attacco di membrana, presentano un’incidenza più marcata di infezioni da Neisseria, inclusa quella da N. meningitidis.
La meningite pneumococcica può essere più frequentemente osservata negli adulti, incidendo per il 13-17% di tutti i casi di meningite negli Stati Uniti ed associandosi ad una mortalità del 19-26%. I pazienti spesso presentano foci di infezione pneumococcica distanti o contigui, come polmonite, otite media, mastoidite, sinusite ed endocardite. Una infezione grave può essere osservata in pazienti con varie condizioni cliniche latenti, inclusa la splenectomia o l’asplenismo, il mieloma multiplo, l’ipogammaglobulinemia, l’alcolismo, la malnutrizione, le malattie croniche epatiche o renali, le neoplasie e il diabete mellito. Inoltre lo Pneumococco è il più comune agente di meningite in pazienti che abbiano riportato una frattura della base cranica con fuoriuscita di liquido cerebrospinale.
La Listeria è responsabile solo del 2-3% delle meningiti batteriche negli Stati Uniti, ma è associata ad una alta mortalità, 22-29%. I sierotipi Ia, Ib, e Ivb sono stati indicati in più del 90% dei casi di meningite provocati da questo patogeno. L’infezione da Listeria è molto comune nei neonati, più del 10% dei casi, in quanto le donne gravide possono ospitare il microrganismo asintomaticamente nel tratto genitale o nel retto e possono così trasmettere l’infezione ai loro bambini durante il parto. Altre condizioni predisponenti comprendono la vecchiaia, l’alcolismo, i pazienti affetti da neoplasie, gli adulti immunodepressi (es. trapiantati renali), pazienti con diabete mellito, malattie epatiche, insufficienza renale cronica, vasculo-collagenopatie e condizioni associate a sovraccarico di ferro. La Listeria solo raramente è stata trovata in pazienti con infezione da HIV nonostante la sua incidenza sia cresciuta nei pazienti con deficienza dell’immunità cellulo-mediata. La meningite può colpire anche adulti precedentemente sani.
Lo Streptococco di gruppo B è la causa più comune di meningite del neonato. Negli Stati Uniti questo microrganismo incide per il 3-6% dei casi con una mortalità che varia dal 12 al 27%. Il rischio di trasmissione dalla madre al suo bambino è aumentato quando l’inoculazione del microrganismo e il numero dei siti di colonizzazione materna sono alti; lo Streptococco di gruppo B è stato isolato dalle colture vaginali o rettali del 15-40% delle gravide asintomatiche. La trasmissione orizzontale è stata anche documentata attraverso il contatto delle mani del personale infermieristico con i bambini. Molti casi di meningite neonatale sono causati dal sottotipo 3 e si verificano dopo la prima settimana di vita. Il gruppo B può causare meningite anche negli adulti e la sua incidenza appare in aumento. I fattori di rischio per gli adulti comprendono l’età oltre i 60 anni, il diabete mellito, il parto, le cardiopatie, le vasculo-collagenopatie, le neoplasie, l’alcolismo, l’insufficienza epatica e renale, la terapia steroidea; malattie manifeste sono state osservate nel 43% dei pazienti.
Questi microrganismi (es.: klebsiella spp., Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.) sono divenuti in modo crescente importanti agenti eziologici in pazienti con meningite batterica. La meningite causata da questi patogeni si è verificata durante un trauma cranico o durante procedure neurochirurgiche e possono anche trovarsi in neonati, negli anziani, nei pazienti immunodepressi ed in caso di setticemia da gram-negativi. Alcuni casi si sono verificati insieme ad una strongilosi disseminata nella sindrome iperinfettiva, nella quale la meningite enterobatterica si presenta come conseguenza dell’interessamento meningeo durante la persistente o ricorrente battieremia associata alla migrazione delle larve infettive. Altra evenienza è quella nella quale le larve possono trasportare gli enterobacilli sulla loro superficie o proprio all’interno del loro apparato gastrointestinale appena escono dall’intestino dell’ospite e secondariamente invadono le meningi.
La meningite causata dallo Stafilococco aureus di solito si presenta nel post-operatorio di interventi neurochirurgici o in pazienti post-traumatizzati, così come in quelli con derivazione del liquido cerebrospinale. Raramente può presentarsi come complicanza infettiva del cateterismo temporaneo epidurale. Altre condizioni latenti comprendono il diabete, l’alcolismo, l’insufficienza renale cronica che necessita di emodialisi, l’abuso di farmaci iniettivi e le neoplasie. Un 35% dei casi si osserva in occasione di un trauma cranico o dopo neurochirurgia ed un ulteriore 20% di pazienti presentano endocardite infettiva latente o infezione paraspinale. Altri casi di meningite stafilococcica contratta in comunità comprendono pazienti con sinusite, osteomielite e polmonite. La mortalità della meningite da S. aureus è stimata tra il 14% ed il 77% in varie statistiche. Lo Stafilococco epidermidis è la causa più comune di meningite in pazienti con derivazione del liquido cerebrospinale.
La meningite da Nocardia normalmente si manifesta in occasione di precise condizioni predisponenti, comprese la terapia con farmaci immunosoppressivi, le neoplasie, i traumi cranici, procedure sul Sistema Nervoso Centrale, la malattia granulomatosica cronica e la sarcoidosi. Gli Enterococchi di solito non si comportano come patogeni. La meningite da anaerobi è infrequente e generalmente è associata a foci contigue di infezione (es. otite, sinusite, faringite, ascesso cerebrale, tumori della testa e del collo, recenti interventi in questi distretti o ferite infette, post-trauma, post-operatorio neurochirurgico). In molti casi può essere rinvenuto più di un microrganismo. I Difteroidi sono diventati importanti agenti eziologici di meningite in pazienti con infezioni a carico delle derivazioni del Sistema Nervoso Centrale.
Potenzialmente tutte le infezioni da micobatteri a carico del S.N.C. sono causate dal bacillo tubercolare Mycobacterium tubercolosis. La meningite tubercolare approssimativamente presenta un’incidenza del 15% tra i casi extrapolmonari e lo 0,7% tra tutti i casi clinici di tubercolosi degli Stati Uniti. Uno sproporzionato incremento di casi di meningite tubercolare si verifica nei "senzatetto" americani e nella popolazione di colore. Molti casi si sono verificati nei bambini durante i primi 5 anni di vita, sebbene l’infezione non presenti un’incidenza più elevata di quanto accada nei primi 6 mesi. Anche altri fattori, come ad esempio l’età avanzata, la terapia immunosoppressiva, i linfomi, la gastroresezione, la gravidanza, il diabete e l’alcolismo sono in grado di compromettere le difese immunitarie, promuovendo una riacutizzazione del processo in pazienti con lesioni tubercolari croniche progressive. L’infezione da HIV ha influenzato l’epidemiologia della TBC negli Stati Uniti. La tubercolosi extrapolmonare si verifica in più del 70% dei pazienti affetti da AIDS (o l’AIDS è scoperto subito dopo la diagnosi di TBC) ma soltanto nel 24-25% dei pazienti con tubercolosi e ancora meno in caso di infezione HIV avanzata.
A. Cryptococcus neoformans. Questo fungo è associato agli escrementi degli uccelli, ma può essere rinvenuto anche nella frutta, nei vegetali, nel latte e nella sporcizia. Il C. neoformans è il più comune fungo causa di meningite clinicamente riconosciuta e colpisce normalmente persone immunocompromesse. Fra questi sono inclusi pazienti affetti da neoplasie del sistema reticolo endoteliale (es. Linfomi), sarcoidosi, vasculo-collagenopatie (es. Lupus eritematosus), diabete mellito, insufficienza epatica o renale cronica, persone che si sono sottoposte a trapianto d’organo e quelli che hanno assunto corticosteroidi. La meningite da Criptococco è stata anche riscontrata in individui apparentemente sani. I pazienti affetti da AIDS normalmente costituiscono il gruppo a maggior rischio; di questi infatti il 6-13% può sviluppare la meningite. B. Candida albicans. La Candida è normalmente un commensale dell’uomo. L’invasione tissutale avviene comunemente in quelle persone con alterate difese immunitarie inclusi pazienti con neoplasie, neutropenia, malattia granulomatosica cronica, diabete, lesioni da calore, persone con catetere venoso centrale, in coloro che ricevono terapia corticosteroidea o chemioterapica ad ampio spettro, o nell’iperalimentazione. La meningite da Candida non è comune e colpisce meno del 15% dei pazienti con candidosi del S.N.C. La Candida albicans è la specie più comunemente isolata.
MODIFICAZIONI NELLA COMPOSIZIONE CELLULARE CHIMICA DEL LIQUOR DURANTE MENINGITI BATTERICHE.
La diagnosi di meningite batterica si fonda sull’esame del liquor per mezzo di puntura lombare o rachicentesi nello spazio tra la 4^ e la 5^ vertebra lombare. Per il prelievo il paziente viene messo in posizione seduta con schiena inclinata in avanti oppure steso sul letto su un fianco con la testa in avanti. Può essere anche eseguita una puntura occipitale nello spazio tra l’Atlante e l’osso occipitale o infine in caso di operazione neurochirurgica può essere prelevato direttamente dal ventricolo (puntura ventricolare). Ciò che più importa nella gestione di un paziente con meningite batterica acuta è la determinazione del più probabile agente eziologico e l’inizio immediato di una terapia antibiotica. Se possibile, campioni di liquor e sangue per coltura dovrebbero essere ottenuti velocemente per gestire al meglio il trattamento. Successivamente i risultati dei test degli Antigeni e la determinazione della concentrazione di proteine e glucosio, della conta cellulare e della differenziazione cellulare potranno essere utili per differenziare precocemente forme batteriche, virali, micotiche e micobatteriche di meningite. I cambiamenti anatomici e fisiologici indotti dalla suddetta infezione sulle meningi sono almeno parzialmente responsabili dei cambiamenti caratteristici dei valori di laboratorio del liquor in pazienti con meningite batterica. La perdita dell’integrità dei capillari cerebrali (e, così, la perdita di integrità della barriera emato-encefalica) porta al passaggio di proteine ed all’aumentata migrazione di leucociti polimorfonucleati nel liquor. Tabella 1 è una compilazione dei valori maggiormente pubblicati e parametri sul liquor più spesso usati in persone sane e in pazienti con meningite. I valori nella Tabella 1 sono linee guida e sono caratteristici di solito di meningite.
Tuttavia, i valori tratti da differenti agenti eziologici spesso coprono circa il 30-40% ma potrebbero essere relativamente normali in alcuni pazienti. Inoltre dovrebbero essere ricercati altri indicatori di meningite batterica nel liquor (es.: endotossine, lattico-deidrogenasi, proteina C-reattiva, TNF prostaglandine, contenuto totale di amminoacidi e IL-1, 2 e 6). Tuttavia, le analisi di routine su liquor per queste molecole non sono eseguite in modo diffuso e accettate a causa della mancanza di sensibilità e specificità documentata, difficoltà tecnica, costi e mancanza di ampia utilità clinica.
RACCOLTA, TRASPORTO, RICEZIONE E DEPOSITO DEL LIQUOR
L’identificazione di un patogeno batterico è spesso essenziale per i medici nella scelta di una terapia antibiotica appropriata e nel trattamento del controllo dell’infezione nelle meningiti batteriche. Per esempio la "American Public Health Association" raccomanda isolamento respiratorio di 24 ore dei pazienti con meningite da N. meningitidis o H. influenzae dopo l’inizio della terapia, e profilassi per le persone che sono state a stretto contatto con questi pazienti. Per iniziare l’identificazione definitiva di un batterio responsabile di meningite, si devono ottenere campioni colturali di liquor e di sangue di pazienti con segnali biochimici e sintomi di meningite che vengano trasportati al laboratorio senza ritardi. Il liquor è ipotonico, quindi i neutrofili potrebbero lisarsi, la conta potrebbe diminuire del 32% dopo 1ora e del 50% dopo 24 ore in campioni di liquor mantenuti a temperatura ambiente. N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae sono organismi esigenti che non potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto o variazioni di temperatura. La refrigerazione potrebbe impedire il mantenimento di questi organismi, quindi i campioni di liquor devono essere mantenuti a temperatura ambiente o in un incubatore (37°C) se questi non possono essere processati immediatamente. La processazione di un campione di liquor è una delle poche procedure di microbiologia clinica che devono essere fatte immediatamente.
DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA MENINGITE BATTERICA
Quando viene prelevato un campione di liquor gli esami da prendere in considerazione sono :
1) ESAME CHIMICO FISICO
2) ESAME MICROBIOLOGICO
3) ALTRI DATI DI LABORATORIO
· PRESSIONE: è virtualmente sempre elevata in tutti i casi con misurazioni superiori a 600 mm di Hg e indica la presenza di edema cerebrale, di foci suppurative e intracraniche o di idrocefalo comunicante.
· ASPETTO E COLORE: in condizioni normali il liquor è limpido, "all’acqua di roccia"; in condizioni patologiche può presentarsi purulento, xantocromico, giallo o con contaminazione ematica. In caso di meningite batterica il liquor è in genere purulento, mentre è limpido nelle meningiti virali. L’aspetto e il colore va guardato sia come arriva sia dopo centrifugazione che viene fatta in laboratorio per osservare eventuale sedimento purulento o ematico. Il colore xantocromico è dovuto alla bilirubina anche se spesso questo termine viene usato per indicare una qualsiasi colorazione diversa dal normale. Un colore giallo chiaro può essere dovuto al fatto che il liquor è molto ricco di proteine. Un liquor fortemente ematico può essere dovuto ad una lesione subaracnoidea ma anche ad una contaminazione durante la rachicentesi. In caso di contaminazione: * facendo una serie di prelievi seriali i globuli rossi decrescono * il sangue non coagula * dopo centrifugazione il sedimento è incolore.
· GLICORACHIA: Calcolo la concentrazione di glucosio che in genere è ridotta a valori intorno a 40 mg % o al di sotto del 50% del corrispettivo livello ematico in caso di meningite batteriche; dato questo attendibile nella distribuzione delle meningiti batteriche dalla maggior parte delle meningiti virali o delle infezioni parameningee. Comunque un glucosio normale non esclude la diagnosi di meningite batterica. L’ipoglicorachia sembra essere dovuta all’interferenza con il normale "carrier" di fusione facilitata per il glucosio da parte delle cellule ospiti (ma è presente anche un consumo di glucosio da parte dei batteri). E’ importante determinare anche il glucosio nel siero considerando che il rapporto normale liquor/siero è 50-60%.
· PROTEINE: Nel liquor in condizioni normali hanno una concentrazione molto bassa 40-50 mg/dl, ma in corso di infezione batterica aumentano molto fino a diventare superiori a 100 mg/dl. Valori maggiori si osservano più frequentemente nella meningite pneumococcica. Le proteine sono un indice di danno della barriera emato-encefalica ma c’è anche una produzione di Immunoglobuline. Per il dosaggio delle proteine nel liquor vengono utilizzati il metodo all’ossido di Pirogalloro e il metodo di Folig Chocaldelau che sono più sensibili del metodo al Biureto utilizzato nel siero.
· CONTA E DIFFERENZIAZIONE CELLULARE: tra 100 e 10.000 per mm/3 con leucociti polimorfonucleati che all’inizio sono > 80% e linfociti che compaiono in seguito. La conta cellulare viene fatta al microscopio mediante la CAMERA DI MAGEOTTE o di BURKER. Sono camere montate su vetrini su cui si fa depositare una certa quantità di liquor colorato che si dispone nel reticolo presente sul vetrino. Le cellule vengono contate diluendo il liquor 1:2 con acqua distillata e acido acetico al 5% e mediante colorazione al Blu di Metilene o al Violetto di Genziana che colorano il nucleo dei globuli bianchi e lisano i globuli rossi.
ESAME DEL SEDIMENTO Il sedimento si forma in seguito a centrifugazione che si rende necessaria per ottenere una concentrazione. Si possono utilizzare: * membrane di concentrazione * camere di sedimentazione * citocentrifuga
Le cellule vengono poi colorate con la colorazione di May-Grunwald-Giemsa che permette di osservare le caratteristiche morfologiche e strutturali delle cellule stesse.
- CONCENTRAZIONE: Le probabilità di isolare un batterio da coltura e attraverso le tecniche di colorazione sono aumentate concentrando i batteri in un campione di liquor. Il numero di batteri presenti in un campione di liquor da un paziente con meningite dovrebbe essere di almeno 10 CFU/ml. In aggiunta, approssimativamente il 50% di pazienti con meningite riceve una terapia antibiotica prima che sia prelevato il campione di liquor la terapia antibiotica potrebbe ridurre il numero di batteri nel liquor con una perdita da 10^2 a 10^6. Generalmente, quando in un laboratorio di microbiologia si riceve un quantitativo < 0,5 ml di liquor, l’intero campione non concentrato viene usato per l’esame microscopico e colturale. Quando è disponibile un quantitativo di liquor > 0.5 ml, per l’esame microscopico e colturale il campione dovrebbe essere concentrato con centrifugazione per almeno 15 minuti a 1500-2500 giri.
- COLTURA: I terreni usati routinariamente per la coltura batterica del liquor sono Agar sangue di montone al 5%, Agar cioccolato arricchito, e un brodo di arricchimento (es.: tioglicolato, columbia, brucella, con supplemento di peptone o ...). Le piastre di coltura dovrebbero essere incubate per almeno 72 ore a 37C. in una atmosfera contenente dal 5 al 10% di anidride carbonica. Una giara con una candela può essere usata se non si ha a disposizione un incubatore ad anidride carbonica. Se la colorazione di Gram dimostra la presenza di bacilli gram-negativi possibili membri della famiglia delle "enterobacteriacee", può essere inoltre seminata una piastra di Agar MacConkey. Se la colorazione di Gram mostra organismi che morfologicamente assomigliano a batteri anaerobi o se si sa che il paziente abbia una condizione a monte che lo renda predisposto a una infezione anaerobica (come otite media cronica), si può aggiungere ai terreni di coltura routinari una piastra di Agar sangue che dovrà essere incubata a 37°C in atmosfera anaerobica. Se possibile, una parte di ogni campione di liquor dovrebbe essere tenuta temporaneamente a -70°C, a temperatura ambiente o a 37°C per una eventuale risemina. Se si prevede di fare il test per la determinazione degli antigeni il campione dovrebbe essere mantenuto ad una temperatura inferiore o uguale a 4°C perché gli antigeni polisaccaridici batterici spesso tendono a rompersi più velocemente a temperatura ambiente e a 37°C piuttosto che a temperatura inferiore o uguale a 4°C. Sebbene concentrazioni batteriche con carica maggiore o uguale 10^7 CFU/ml di liquor siano correlate ad una aumentata morbilità e mortalità, l’esame colturale quantitativo di campioni di liquor non viene considerato una procedura comune e pratica. La crescita della normale flora epidermica dovrebbe far pensare ad una contaminazione, specialmente quando c’è una crescita minima sul terreno solido o crescita su una singola piastra o solo nel brodo. Le piastre di coltura senza crescita potrebbero essere scartate dopo 72 ore, e i brodi di arricchimento negativi potrebbero essere scartati dopo 5 giorni di incubazione.
TEST DI SUSCETTIBILITA’ ANTIMICROBICA (ANTIBIOGRAMMA)
Le colture positive vengono processate per ottenere l’identificazione dei germi e la loro sensibilità agli antibiotici al fine di fornire al clinico indicazioni sulla corretta terapia da attivare.
· Ricerca endotossina: positiva per meningiti da Gram-negativi, ma non per gram-positivi. · Proteina C reattiva: aumentata in circa il 95% dei soggetti con meningite batterica e non è aumentata nella maggior parte dei pazienti con meningite virale. · Ricerca LDH: l’isoforma LDH 5 è presente solo nelle meningiti batteriche. · VES: elevata. · Studi radiologici: esecuzione di TAC per documentare edema cerebrale, allargamento degli spazi subaracnoidei, aree focali di aumentata densità a causa dell’infiammazione cerebrale o della necrosi associata, ascessi subdurali. Comunque i pazienti con meningite raramente presentano reperti TAC significativi in assenza di reperti neurologici focali. · EEG: risulta alterata anche precocemente per la comparsa di onde lente mono o polimorfe, diffuse o lateralizzate, prevalentemente nelle regioni temporo-occipitali.
MICROSCOPIA Una quota di tutti i campioni di liquor viene colorata con la colorazione di Gram (o altre colorazioni comparative) e esaminata microscopicamente. Per il fatto che l’utilità diagnostica delle procedure di colorazione dipenda dalla concentrazione batterica nel liquor ( da 10 a 10^9 CFU/ml.), tutti i campioni di liquor di quantità sufficiente vengono trattati per concentrare i patogeni prima dell’osservazione al microscopio e della coltura.
COLORAZIONE DI GRAM
La colorazione di Gram è un metodo semplice, rapido, accurato e poco costoso per l’identificazione di batteri e cellule infiammatorie nel liquor da pazienti con meningiti batteriche. Una percentuale tra il 75 e il 90% di colture liquorali positive trovano conferma nella colorazione di Gram, le percentuali diminuiscono tra il 40 e il 60% in pazienti che hanno ricevuto terapia antibiotica prima della puntura lombare. La colorazione di Gram è generalmente considerata più attendibile per la determinazione di batteri in concentrazione maggiore o uguale a 10^5 per ml. dell’intero fluido. La presenza, il numero e la morfologia dei batteri, cellule infiammatorie, e eritrociti vengono riportati immediatamente. L’utilità clinica della colorazione di Gram apparentemente dipende dal batterio patogeno. Alcuni addetti ai lavori preferiscono usare la fucsina basica come contrasto al Gram per ottenere una colorazione migliore in organismi come l’Haemofilus spp. e il Fusobacterium spp. che si colorano poco con la safranina.
COLORAZIONE ALL’ARANCIO DI ACRIDINA
L’arancio di acridina è un fluorocromo che può intercalarsi nell’acido nucleico. Ad un basso pH (4,0), i batteri e lieviti appaiono rosso vivo, e i leucociti appaiono di un pallido verde mela. Questa colorazione leggermente più sensibile della colorazione di Gram (82,2% comparata al 76,7%) è in grado di identificare batteri a concentrazioni maggiore o uguale 10^4 CFU/ml. Un’altro vantaggio di questa colorazione è una riduzione del tempo utilizzato per esaminare un vetrino, dovuta allo straordinario contrasto tra i batteri luminosi e lo sfondo scuro e all’uso di ingrandimento di solo 400x per esaminare molti vetrini. Un grande svantaggio di questa tecnica è che richiede un microscopio a fluorescenza.
COLORAZIONE WAYSON
La colorazione Wayson appare essere una colorazione semplice e sensibile per scrinare vetrini di liquor per batteri. Le componenti della colorazione sono la fucsina basica, blu di metilene, etanolo, fenolo. Daly e collaboratori trovarono che la colorazione Wayson era più sensibile (90%) rispetto la colorazione di Gram (73%) e che era specifica (98%) quanto questa (99%) nella determinazione di batteri in vetrini di liquor. Nelle preparazioni della colorazione, i batteri appaiono blu scuro, il materiale proteico di blu vivo, e i leucociti di porpora.
PROCEDURA QUELLUNG
La reazione capsulare di Quellung è usata raramente, ciononostante, può essere usata per confermare la presenza di organismi con una tipica morfologia: - Pneumococco - N. meningitidis - H. influenzae di tipo B Nella procedura della reazione Quellung, specifici antisieri per i polisaccaridi capsulari di ognuno di questi 3 batteri sono mescolati con porzioni separate di campioni clinici. Specificatamente, una goccia di liquor, una goccia di antisiero specifico e blu di metilene saturato vengono miscelati su un vetrino per microscopio coperto e esaminato sotto un obiettivo con olio. La formazione dei complessi Antigene - Anticorpo sulla superficie di questi batteri induce cambiamenti negli indici di rifrazione delle loro capsule. Microscopicamente, la capsula appare essere chiara e rigonfia. Il test richiede anticorpi altamente specifici ad alto titolo e un tecnico con esperienza nel metodo.
DEGLI Ag BATTERICI
Agglutinazione al lattice (LA), Coagglutinazione (COAG) e Controimmunoelettroforesi (CIE) sono stati adottati per la determinazione rapida e diretta degli antigeni batterici solubili in liquor di pazienti con sospetto di meningite batterica. Questi test sono molto usati nei laboratori di microbiologia clinica e possono essere importanti supplementi alla coltura e alla colorazione di Gram per i campioni di liquor. I test rapidi per la determinazione degli antigeni potrebbero fornire risultati veri-positivi quando i risultati della coltura e della colorazione di Gram sono negativi per pazienti con meningite che hanno ricevuto terapia antibiotica. Inoltre i risultati di questi test rapidi possono indicare al medico di effettuare per tempo una terapia antibiotica specifica piuttosto che una terapia ad ampio spettro che è di solito istituita fino a che i risultati della coltura e dell'antibiogramma siano disponibili, cioè in 18-24 ore. I più comuni patogeni del Sistema Nervoso Centrale verso i quali viene applicato il test per la determinazione degli Antigeni sono: - l’H. influenzae di tipo B, - Pneumococco, - Streptococco di gruppo B, - N. meningitidis, sierogruppi A, C, Y e W135. - N. meningitidis sierogruppo B/E.Coli k1. Eccetto per lo Streptococco di gruppo B questi batteri possiedono antigeni polisaccaridici capsulari solubili e tipo - specifici che sono rilasciati nei tessuti corporei circostanti e nei liquidi.
AGGLUTINAZIONE AL LATTICE Il test eseguito di routine nel nostro laboratorio è quello della agglutinazione al lattice che si basa sul principio che anticorpi specifici sono fissati sulla superficie di particelle di lattice e l’aggregazione è tale da permettere la rapida visualizzazione dell’agglutinazione in presenza di antigeni specifici. Il test si esegue nel seguente modo: a) I campioni di liquor vengono riscaldati per 3 minuti a 100°C (per es. bagno termostatato o unità di riscaldamento) e lasciati raffreddare fino a temperatura ambiente prima del dosaggio. Per una sensibilità ottimale le analisi di N. meningitidis di gruppo B e di E. coli K1 andrebbero effettuate con campioni non riscaldati. b) I campioni di liquor soprattutto se torbidi vengono centrifugati dopo il riscaldamento per 10 minuti a 1.400 X g, prima dell’analisi. Si preleva il sopranatante come campione da analizzare. c) Si dispensano 50 microlitri di campione così trattato nell’apposito cartoncino a fondo nero su cui sarà evidente l’agglutinazione del lattice in caso di positività. d) Si dispensano quindi le gocce di reagente specifico per i vari microorganismi. e) Si mescola il campione e la sospensione di lattice con un miscelatore. f) Dopo aver fatto ruotare il cartoncino per 10 minuti si legge il risultato ad occhio nudo sotto una lampada ad alta intensità.
Questo tipo di test può essere effettuato anche su altri materiali come siero, liquido pleurico e urine. Il siero è spesso un campione povero per la determinazione di polisaccaridi capsulari liberi perché l’antigene può legarsi ad anticorpi e altre proteine sieriche, essere metabolizzato , e/o essere rimosso dai linfociti. Le urine potrebbero servire come una alternativa al liquor perché possono essere ottenute in modo non invasivo, velocemente e concentrate per aumentare la possibilità di determinare gli antigeni soprattutto se il paziente è in terapia da più di 24 ore (da tenere presente le possibili cross-reazioni dovute a flora uretrale). In pazienti con meningite batterica trattati con successo con antibiotici, gli antigeni batterici sono stati trovati nei liquidi corporei per molti giorni dopo che il liquor è diventato sterile. La procedura per la determinazione degli antigeni in questi materiali è la stessa che per il liquor con la differenza che in questo caso il campione prima di tutto va diluito 1:1 con un tampone specifico per materiale e le urine se troppo torbide vanno prima centrifugate a 1.400 giri per 10 minuti.
COAGGLUTINAZIONE
I reagenti per la COAG sono composti di sospensioni di S.aureus (in particolare Cowan di tipo 1) che contiene la proteina A, componente della superficie cellulare, una proteina del peso molecolare di 12.000 - 43.000 daltons che è legata covalentemente al peptidoglicano del batterio. Molecole di IgG (dirette contro l’antigene di interesse) si attaccano alla proteina A attraverso la terminazione Fc della molecola di IgG mentre la terminazione Fab immunoreattiva rimane libera di reagire con l’antigene specifico. In presenza dell’antigene specifico, avviene una agglutinazione degli stafilococchi ben visibile. COAG e LA hanno grandi vantaggi rispetto alle altre reazioni nella diagnosi rapida di laboratorio di meningite batterica. I due test sono rapidi (minori o uguale a 15 minuti), semplici da eseguire e non richiedono apparecchiature particolari. La semplicità e la velocità di esecuzione di questi due test li rende adatti per l’uso nel laboratorio di microbiologia clinica in tutti i cambiamenti dello stato basale.
CONTROIMMUNOELETTROFORESI
CIE era una volta un metodo diagnostico importante e rapido per la diagnosi di laboratorio di meningiti batteriche. Nella CIE, l’applicazione di una corrente elettrica ad un Agar di immunodiffusione accelera la diffusione nella direzione voluta dell’antigene e dell’anticorpo. L’introduzione di reagenti commercialmente disponibili per COAG e LA per la determinazione di patogeni liquorali ha fatto della CIE un test attuato in solo pochi laboratori. CIE è meno sensibile (un fattore di 10) che la COAG e LA nella determinazione degli antigeni batterici nel liquor e nelle urine tuttavia, CIE ha una specificità eccellente. CIE è usata oggi solo raramente perché richiede antisieri di alta qualità, controllo di qualità rigorosa, apparecchiatura speciale, e un analista di esperienza per ottenere una ottima sensibilità ed è inoltre scomoda e lenta quando è comparata con la COAG e LA.
TEST IMMUNOENZIMATICI
Le reazioni immunoenzimatiche per la determinazione degli antigeni batterici nel liquor utilizzano anticorpi specifici (primari) legati ad un supporto solido come un vetrino da microscopio di plastica o una provetta, o palline di polistirolo. Se l’antigene batterico analogo è presente nel campione di liquor, l’antigene verrà legato dall’anticorpo primario immobilizzante. Un anticorpo (secondario), marcato con un enzima, che è specifico per l’antigene batterico di interesse, si lega all’antigene unito all’anticorpo primario. L’aggiunta di un substrato per l’enzima porta alla produzione di colore se è presente nel campione di liquor l’antigene batterico specifico e se questo si è legato all’anticorpo primario. Le reazioni immunoenzimatiche sono state valutate per la loro abilità nel determinare nel liquor gli antigeni per l’H. influenzae di tipo B, lo Pneumococco e la N. meningitidis. I test possono determinare antigeni batterici in concentrazioni di 0,1 - 5 ng/ml. Attualmente, test in commercio per la determinazione di antigeni batterici nel liquor sono disponibili solo in Europa (Behring, una procedura all’avidina-biotina; Pharmacia, una procedura alla perossidasi). Questi test generalmente richiedono molte ore per essere completati e richiedono controlli multipli
LIMULUS TEST
Questo test permette l’identificazione solo dei batteri Gram negativi. Il fluido circolante simile al sangue del LIMULUS POLYPHEMUS, è chiamato emolinfa, in cui le sole cellule circolanti sono detti amebociti. Sotto condizioni ottimali ( 36-38% C., pH 6,0-7,5), un lisato derivato dagli amebociti del L. Polyphemus coagula entro 1 ora quando esposto a quantitativi molto piccoli di lipopolisaccaride (endotossina), che è contenuto nella parete cellulare di tutti i batteri gram-negativi. Il componente attivo del liposaccaride batterico sembra essere in questa reazione il lipide A (pirogeno), che in concentrazioni anche di 0.1 ng per ml sono in grado di coagulare il lisato amebocitico. Il Limulus test quindi è un test quantitativo per la determinazione di endotossine prodotte dai batteri Gram negativi che però non ha trovato uso diffuso come strumento diagnostico per meningite nonostante sia un test rapido ( 1 ora ), con una buona sensibilità ( 93% ) e una buona specificità (99% ). I motivi del fallimento consistono nel fatto che questo strumento diagnostico determina solo batteri Gram negativi e non permette il differenziamento tra i diversi tipi all’interno della classe. Inoltre recenti studi hanno dimostrato che la percentuale di sensibilità diminuisce notevolmente (71%) per la diagnosi di meningiti neonatali da Gram negativi e quindi il test non può essere utilizzato come procedura di screening in campo pediatrico.
GASCROMATOGRAFIA
La gascromatografia (GLC) fu usata all’inizio in microbiologia clinica per identificazione di batteri anaerobi. Questa tecnica facilita la separazione, la quantificazione e l’identificazione di molti costituenti (spesso tracce) dei liquidi corporei. Amine, alcoli, carboidrati e catene leggere di acidi grassi sono esempi di metaboliti microbici che sono prodotti nei tessuti corporei e nei fluidi e che possono essere determinati da tale tecnica. Il campione che deve essere analizzato viene introdotto nel foro di un iniettore incandescente dove il materiale viene volatilizzato. Il campione si miscela così con un gas inerte che funge da trasportatore e avanza attraverso una colonna incandescente. L’affinità del gas per la fase liquida determina la velocità con la quale essi avanzano lungo la colonna. Un cambiamento del segnale elettrico è dovuto al fatto che i gas passano attraverso un detector e queste modificazioni sono amplificate per deviare una "pen-recorder", che produce tracciati che rappresentano il tempo e la concentrazione di ciascun gas. L’applicazione della gascromatografia per la determinazione e l’identificazione di microrganismi nel liquor è ancora ad un livello di sviluppo. Croven e collaboratori hanno presentato dati dimostranti che la GLC può essere usata per differenziare tra infezioni criptococciche, tubercolari, virali e parassitiche a carico del Sistema Nervoso Centrale. Brice e collaboratori hanno utilizzato questa tecnica per stabilire modelli cromatografici per cinque comuni agenti batterici responsabili di meningite: S.pneumoniae, H.influenzae, N. meningitidis, S.aureus e E.Coli. L’applicazione di questa tecnica diagnostica per la determinazione e l’identificazione di microorganismi nel liquor è ancora ad un livello di sviluppo e non ha avuto largo utilizzo per la diagnosi di meningite batterica per molte ragioni. La tecnica richiede una strumentazione e apparecchiature molto costose, e la metodologia è molto più complessa e meno specifica che la reazione per la determinazione degli antigeni in uso in molti laboratori. Inoltre diventa necessaria una valutazione dei risultati assistita da computer per l’interpretazione dei dati gascromatografici (sfondi svianti e artefatti possono dare problemi nell’identificazione), e personale esperto.
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENA (PCR)
La reazione di polimerizzazione a catena o PCR è una tecnica mediata da "primer" e temperatura-dipendente per l’amplificazione esponenziale enzimatica di una specifica sequenza di DNA, facilmente automatizzata in quanto tutte le reazioni avvengono in un singolo contenitore. La tecnica permette di ottenere grossi quantitativi di DNA da studiare laddove non sia stato possibile l’isolamento, partendo da una quota di DNA stabile del campione, due sequenze di "primers" cioè oligonucleotidi a singola catena di 20/30 paia di basi che fiancheggiano da entrambe le parti la sequenza che deve essere amplificata, una DNA polimerasi termostabile dal batterio "Thermus acquaticus" e grosse quantità di trifosfato delle quattro componenti deossiribonucleosidiche del DNA. La tecnica si basa su cicli ripetitivi di tre semplici reazioni in cui la temperatura è portata a 94°C per denaturare il DNA in modo che si aprano i due singoli filamenti e si mantengano separati, viene poi abbassata a 55°C per l’aggancio dei "primers" oligonucleotidici alle loro regioni complementari sul tratto di DNA a singola catena ( primer purificati ) e infine rialzata a 72°C per permettere l’aggancio della Taq polimerasi, l’estensione dei primers e quindi la sintesi di DNA a doppia catena da ogni singola catena stampo. L’azione della polimerasi va avanti fino al successivo ciclo, fino a quando cioè non viene rialzata nuovamente la temperatura per una nuova sequenza di reazioni. Se il ciclo di queste tre reazioni è ripetuto trenta volte, un segmento di DNA può essere amplificato da un fattore di 10^6, di solito in tre /quattro ore. Successivamente, sonde di acido nucleico sono usate per determinare i prodotti della reazione di PCR e quindi l’organismo specificatamente ricercato nel campione del paziente. La PCR è stata utilizzata recentemente nella determinazione precoce della N. meningitidis nel liquor di un paziente con meningite. Le emocolture del paziente erano positive per il microrganismo, ma la coltura, la colorazione di Gram e la colorazione dell’arancio d’acridina del liquor non evidenziarono la presenza di batteri. Il liquor era purulento, con 48.000 leucociti polimorfonucleati per microlitro di campione. Il paziente aveva ricevuto penicillina intravenosa trenta minuti prima che fosse fatto il prelievo di liquor. L’uso della PCR e delle sonde di acidi nucleici avrebbe potuto provare una precoce e definitiva diagnosi di meningite meningococcica in questo paziente se il test fosse stato fatto sul liquor quando il paziente era stato ricoverato in ospedale. La conclusione ha portato ad affermare che la PCR è un metodo rapido per l’amplificazione di DNA e può essere estremamente utile nella diagnosi rapida di laboratorio di meningite causata dalla N. meningitidis quando il paziente abbia ricevuto prima del prelievo terapia antibiotica. Infatti è dotato di alta sensibilità, specificità e non risente della terapia antibiotica ma non viene comunque inserito nel programma routinario a causa dei tempi lunghi (6-24 ore), della necessità di personale specializzato e del fatto che risente della presenza di eventuali inibitori e di contaminazioni. La seguente tabella riporta un confronto di sensibilità dei principali metodi per la determinazione degli antigeni batterici rispetto ai patogeni più comuni del SNC:
P.S.: Il Limulus test non è stato citato in quanto limitato ai soli batteri Gram negativi e la Gascromatografia non è stata citata in quanto viene considerata tuttora una tecnica sperimentale.
Allo scopo di dimostrare l’importanza della diagnosi rapida nelle meningiti batteriche, è stato fatto un lavoro di ricerca per ottenere dei dati da confrontare coi valori internazionali già precedentemente citati. Le caratteristiche che si è cercato di evidenziare riguardano:
· Le percentuali di isolamento dei vari agenti eziologici della malattia totali e relative ai reparti di provenienza dei campioni liquorali; quindi l’evidenziazione di casi presumibilmente di origine nosocomiale o di origine comunitaria. · Le percentuali di isolamento per fascia di età. · L’analisi dei valori dei parametri chimico-fisici (globuli bianchi, VES o velocità di eritrosedimentazione, glucosio, proteine, cellularità,...) dei liquor di pazienti con meningite a liquor limpido e a liquor torbido. · I valori di sensibilità e specificità e quindi l’attendibilità del test per la determinazione degli Antigeni solubili batterici e quelli criptococcici. La ricerca è stata fatta considerando 1.113 campioni di liquor pervenuti in laboratorio e appartenenti a 610 diversi pazienti ricoverati in vari reparti dell’azienda "Ospedali Civili di Brescia". I campioni di liquor sono stati inviati al laboratorio di Microbiologia e Virologia dell’ospedale per essere analizzati come Liquorcolture nel periodo di tempo che va dal 1° gennaio 1997 al 30 aprile 1999.
I reparti di provenienza sono stati raggruppati in :
1) - Reparto di Rianimazione (comprende la 1°e la 2° rianimazione).
2) - Reparto di Neurochirurgia (comprende i reparti di Neurologia maschile e femminile, la NCH , la NCH cerebrale e la NCH spinale).
3) - Reparto di Medicina generale (comprende la 1°, 2° e 3° Medicina maschile e femminile, il reparto di Cardiologia e Cardiochirurgia, Dermatologia, Nefrologia, Pediatria, Ginecologia e Medicina Legale).
4) - Reparto di Malattie Infettive (comprende la 1° e la 2° Divisione).
Nel reparto di Rianimazione e nel reparto di Neurochirurgia vengono ricoverati pazienti in seguito a incidente o intervento chirurgico, nel primo, e pazienti sottoposti a manovre chirurgiche a livello cerebrospinale, nel secondo, quindi persone traumatizzate, cateterizzate e sensibili di conseguenza a infezioni particolari a carico soprattutto di saprofiti della cute o delle prime vie respiratorie o patogeni opportunisti. Spiccano, infatti, gli Stafilococchi coagulasi negativi come lo Stafilococco epidermidis, batteri come lo Stafilococco aureus e lo Pseudomonas aeruginosa che non hanno un particolare tropismo per le meningi e batteri che in genere danno patologie a livello intestinale come gli Enterococchi, la Morganella e il Proteus. Poco rappresentativi risultano invece essere i normali patogeni che provocano meningite come Neisseria e Pneumococco che sono stati isolati solo in piccole percentuali. Dai dati ottenuti si evidenzia inoltre il fatto che il numero di campioni liquorali è alto rispetto al numero dei pazienti in quanto, normalmente, in questi reparti i pazienti vengono ricoverati a lungo e monitorati giorno per giorno per evidenziare al nascere l’insorgere di eventuali infezioni.
Nel reparto di Medicina generale abbiamo due tipi di probabile infezione, una di tipo nosocomiale dovuta al fatto che i pazienti possono subire anche degenze prolungate e una di tipo comunitario per cui il ricoverato viene immediatamente trasferito al reparto di competenza cioè al reparto di Malattie infettive. Un accenno particolare all’isolamento di un caso di Streptococco agalactiae in quanto negli ultimi anni è diventato uno dei più importanti agenti patogeni per il neonato. Questo batterio, infatti, può essere presente come commensale nell’uretra maschile e a livello vaginale nella donna ed è trasmissibile attraverso il rapporto sessuale. Il bambino si infetta al momento del parto durante il passaggio attraverso il canale del parto infetto da cui derivano due tipi di manifestazioni cliniche, una malattia di insorgenza precoce nelle prime 48 ore di vita che si manifesta come sindrome polmonare acuta spesso accompagnata da meningite con alta mortalità (50%), e una sindrome più tardiva entro i primi due mesi caratterizzata costantemente dalla presenza di meningite purulenta con danni neurologici gravi ma con più bassa mortalità (20%). All’interno degli isolamenti sono da evidenziare 3 casi provenienti dalla Medicina Legale e quindi isolati da persone decedute di meningite a carico di: N. meningitidis, Enterobacter aerogenes e Escherichia Coli. Per quanto riguarda il reparto di Malattie Infettive importante è evidenziare il fatto che esistono due tipi di pazienti che vengono ricoverati con una sintomatologia che fa sospettare un caso di meningite come febbre elevata, cefalea grave, rigidità nucale, vomito a getto: * i pazienti HIV negativi che sono colpiti da meningite a livello comunitario a carico dei più comuni patogeni a livello meningeo e cerebrospinale come N. meningitidis, Pneumococco, H. Influenzae, ... spesso in seguito a otite o sinusite che degenerano. * i pazienti HIV positivi, cioè persone con una immunodeficienza di fondo che li rende sensibili anche a microorganismi che in soggetti normali non sono in grado di dare patologie come Stafilococchi, coagulosi negativi, Streptococchi viridanti, Listeria monocytogenes, e soprattutto miceti come il Criptococco che è appunto isolato quasi esclusivamente in questo genere di pazienti.
I dati ottenuti sono stati raccolti nei seguenti istogrammi: REPARTO DI NEUROCHIRURGIA REPARTO DI RIANIMAZIONE REPARTO DI MEDICINA GENERALE REPARTO MALATTIE INFETTIVE Sotto le voci Altri sono raccolti: (*) : Enterococchi, Difteroidi, Bacillus, Morganella e Proteus. (**) : Enterococco, Difteroidi, Bacilli e Morganella. (***) : Flavobacterium e Stenotrophomonas Moltophilia. (****): Bacillus, Difteroidi e Klebsiella.
Secondo scopo della ricerca è quello di elaborare i dati ottenuti per ottenere delle percentuali di isolamento per fasce di età da confrontare coi valori ufficiali. La seguente tabella quindi comprende i dati ottenuti su un totale di 145 campioni di liquor di pazienti di età nota affiancati da valori internazionali:
Terzo obiettivo della ricerca è stato quello di analizzare i cambiamenti dei parametri biochimici del liquor e di alcuni valori del sangue in corso di meningite. Come spiegato meglio precedentemente infatti le modificazioni di alcuni valori liquorali non sono casuali e possono essere d’aiuto nell'identificazione del tipo di patologia. La seguente tabella mette a confronto i valori ufficiali di tali parametri (concentrazione di globuli bianchi nel sangue, VES, concentrazione nel liquor di proteine, glucosio e cellularità ) con i valori da noi ottenuti :
La diagnosi di meningite tubercolare può essere posta mediante esame microscopico diretto del liquor cefalo rachidiano colorato con la tecnica di Ziehl Neelsen o con Auramina e Rodamina ed esami colturali su terreni solidi tradizionali o terreni liquidi (metodo radiometrico) o mediante reazione di amplificazione genica. I tre metodi presentano tempi di esecuzione variabili da trenta minuti per la ricerca microscopica a 6 - 8 ore per la reazione di amplificazione genica e di 4 - 8 settimane per l’indagine colturale. A questo proposito si fa rilevare come l’introduzione di metodologie colturali in medium liquido con successiva rilevazione radiometrica della crescita batterica, abbia significativamente ridotto i tempi di coltura dei micobatteri, e se si considera la possibilità di abbinare ad esse la tipizzazione mediante sonde di acidi nucleici con metodi di ibridazione che danno risultati in poche ore, è facile rendersi conto del progresso compiuto nel campo della micobatteriologia di laboratorio. Per quanto invece attiene alla sensibilità, l’esame microscopico per la ricerca dei micobatteri nel liquor si attesta su percentuali del 20 - 30%, la PCR varia ampiamente tra 33 - 90%, l’indagine colturale sul 90% con specificità rispettivamente nulla, dello 88 - 100% e del 100%. Ulteriore obiettivo della ricerca elaborare i dati raccolti per calcolare i valori di sensibilità e specificità del test per la determinazione degli Antigeni solubili batterici. La sensibilità di un metodo viene definita sulla base della più piccola grandezza che il metodo è in grado di riconoscere come diverso da zero, ad un livello determinato di significatività statistica e il valore di questa grandezza minima o limite di rilevazione dipende dalla precisione del metodo. Il valore numerico della sensibilità di un metodo si ottiene dall’operazione matematica:
TOTALE POSITIVI / ( TOTALE POS.+FALSI NEGATIVI)X100
La specificità viene invece definita come la proprietà del metodo per la quale esso è in grado di misurare solo e unicamente la grandezza per cui viene impiegato e quindi dipende dall’accuratezza del metodo stesso. Il suo valore numerico è dato da:
TOTALE POSITIVI / ( TOTALE POS.+FALSI POSITIVI )X100
I valori di sensibilità ottenuti dall’analisi di campioni di liquor, di siero e di urine sono:
Da questa tabella emergono alcune considerazioni importanti. Innanzitutto, considerando i tre materiali, la più alta sensibilità registrata è quella riguardante l’H.influenzae per cui si ottiene una percentuale massima nell’applicazione del test al lattice alle urine. Considerando che l’Haemofilus è il più frequente patogeno causa di meningite in età pediatrica, questo risulta importante in quanto le urine costituiscono un materiale di ben più facile reperibilità rispetto al liquor e quindi si può ipotizzare la possibilità di una diagnosi di meningite che faccia evitare la puntura lombare che comporta comunque sempre dei rischi. Un’altra considerazione riguarda la N. meningitidis che invece è rappresentata dai valori più bassi di sensibilità e questo è spiegabile considerando la quantità minima rilevabile del test, cioè la sensibilità espressa in nanogrammi, che per quanto riguarda la Neisseria è molto alta (50-100 ng/ml) rispetto a quella dell’H.influenzae che invece è più bassa (0,1-5 ng/ml) ed infatti è rappresentato da valori di sensibilità alti. La N. meningitidis inoltre non è rilevabile nelle urine come gli altri patogeni testati con tale prova. Un accenno infine merita la diagnostica di meningite da Criptococco anche alla luce della diffusione di tale patologia nei soggetti HIV positivi. Essa si fonda sull’esame microscopico diretto del liquor colorato con inchiostro di china, in grado di evidenziare la caratteristica capsula di Criptococcus neoformans, sulla coltura in terreno liquido che può richiedere tempi anche relativamente lunghi (7-10 giorni) e soprattutto sulla ricerca di antigeni solubili mediante test di agglutinazione al lattice, o saggio immunoenzimatico. Particolarmente interessante risulta il test di agglutinazione al lattice che, utilizzando particelle di lattice sensibilizzate da un anticorpo monoclonale contro i mannani della parete criptococcica ha un limite di sensibilità di soli 50 ng/ml di antigene; dà risposte in pochi minuti e consente anche una valutazione quantitativa in grado di dare indicazioni prognostiche e sull’efficacia della terapia antimicotica. Dai dati ottenuti sono emersi 17 casi di meningite da Criptococco in pazienti HIV+ in cui la diagnosi si è basata sull’indagine colturale e la ricerca degli antigeni solubili specifici. Dei 17 casi, sono stati individuati 5 casi falsi-positivi e nessun caso falso-negativo, quindi di conseguenza si è ottenuto un valore di sensibilità del 100% e un valore di specificità del 70%.
Da quanto fin qui esposto si evince che:
* L’esame chimico-fisico può dare soltanto una indicazione di massima per quanto concerne l’eziologia della meningite nel senso che nelle forme batteriche evidenzia in genere più di 1.000 leucociti/ml di liquor con il 50 % di neutrofili, una glicorrachia inferiore a 30 mg/dl ed una proteinorrachia superiore a 100 mg/dl; mentre in quella da funghi i leucociti arrivano fino a 500/ml., la glicorrachia è inferiore a 40 mg/dl, i neutrofili inferiori al 10% e le proteine comprese tra 50 mg/dl e 100 mg/dl. Questi dati corrispondono grosso modo ai valori ottenuti dalla nostra ricerca tranne che per il valore del glucosio nelle meningiti da miceti che risulta essere superiore al valore sopraddetto.
* L’esame microscopico del liquor, colorato con il metodo di Gram presenta il vantaggio di essere rapido, poco costoso, di dare una visione generale del campione ma è troppo spesso poco sensibile variando del 25% se la carica microbica iniziale del liquor è inferiore a 1.000 elementi/ml al 97% se superiore a 100.000/ml, inoltre non riesce sempre ad identificare tutti i batteri spesso lisati ed alterati nella loro morfologia e nel loro comportamento tintoriale della terapia in corso.
* L’indagine colturale, combinando terreni liquidi o solidi, presenta sicuramente una maggiore sensibilità ed una ben più elevata specificità in quanto è possibile l’identificazione e tipizzazione più accurata del ceppo cresciuto ed ha consentito di tracciare un quadro completo dei principali microorganismi responsabili di meningiti purulente che per l’80% dei casi sono risultati: Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, mentre nei pazienti immunocompromessi anche Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeuriginosa e Criptococcus giocano un ruolo estremamente importante così come Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus aureus costituiscono la quasi totalità delle infezioni nei pazienti con derivazione liquorale.
Questi dati sull’eziologia delle meningiti batteriche sono stati confermati anche dai nostri dati. L’isolamento comunque di microrganismi responsabili di meningiti, non sempre risponde perfettamente alle esigenze diagnostiche che, come già accennato in precedenza, richiedono tempi brevissimi e dunque enfatizzano l’utilità di test rapidi, come la ricerca ha messo a punto e reso disponibili, come ad esempio il Limulus test, la gascromatografia, la controimmunoelettroforesi, la coagglutinazione, l’agglutinazione al lattice e la reazione di amplificazione genica (PCR), ciascuno dei quali presenta caratteristiche peculiari, già ampiamente discusse. Il Limulus test, test quantitativo per la determinazione di endotossine prodotte da batteri Gram negativi presenta il vantaggio della estrema rapidità (1 ora) ma è limitato ai casi di meningiti da Gram negativi ed anche in tale ambito manca assolutamente di specificità. In conclusione la necessità di una diagnosi eziologica la più rapida possibile ha portato all’applicazione, nella diagnostica delle meningiti, di metodiche alternative rispetto a quelle tradizionali. Non tutte si sono rilevate di pratico interesse in questo campo, anzi, alla luce di quanto emerge dall’esperienza personale e dai dati della letteratura, soltanto la ricerca degli antigeni solubili in corso di meningiti batteriche e fungine e la reazione di amplificazione genica in corso di alcune forme da micobatteri nelle quali anche un suo risultato negativo abbinato ai dati microscopici ha un’importante valore predittivo di negatività, sono risultate di utilità diagnostica nel ridurre i tempi di risposta, anche perché nell’epoca dei finanziamenti sanitari in base al Disease Related Groups (DRG) anche valutazioni rigorose di economia e quindi di costi - beneficio devono essere attuate allorquando si utilizzano metodiche di diagnosi.
Durante le mie ricerche ho consultato diversi motori di ricerca ho visto diversissimi siti tutti più o meno utili, alcuni di privati altri di enti governativi o di case farmaceutiche ve ne riporto alcuni qui con una breve descrizione. P.S. ho constatato purtroppo che nonostante la medicina in italia non ha nulla da invidiare a quella internazionale, per quanto riguarda internet purtroppo siamo molto indietro troviamo ben poco di autori o di enti italiani molti dei siti qui elencati sono in lingua inglese, al termine dei link troverete quello che secondo noi è uno dei migliori siti privati in italiano. Innanzitutto una serie di motori di ricerca italiani che ho consultato, sicuramente molti li conoscerete:
prova oppure con: |
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poi ancora:
EXCITE / VIRGILIO / IL TROVATORE / SHINYSEEK
Altri motori di ricerca
LYCOS / YAHOO / ALTAVISTA / CERCA.COM / GOOGLE / ASK / OINGO
Miglior motore di ricerca a mio parere per quanto riguarda pubblicazioni mediche:
PUBMED (gestito dalla National Congress Library) / DEMATEL server italiano dedicato alle risorse biomediche in internet
siti governativi in cui vale la pena fare un salto:
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA' / MINISTERO DELLA SANITA' /
Associazioni:
ASSOCIAZIONE MICROBIOLOGI ITALIANI / AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY
Università:
ISTITUTO DI MICROBIOLOGIA RENZO DAVOLI UNIVERSITA' DI FIRENZE / SCAMBI DI APPUNTI UNIVERSITARI / UNIVERSITA' DI BRESCIA
L'ho lasciato per ultimo ma non per questo è un sito di minor importanza, anzi è un sito finalmente italiano dove ho risolto gran parte dei miei problemi di ricerca con addirittura un percorso guidato nei vari siti di interesse microbiologico e medico in generale, semplice, chiaro esaustivo DA VEDERE:
BREVE CORSO DI BATTERIOLOGIA DEL PROF. BIANCO