Può avvenire_
- tramite sostituzione di basi, su DNA già preformato (il mio gene clonato che viene trattato con mutageni chimici);
- oppure io posso sostituire le basi durante la sintesi del DNA, e questo può avvenire:
. perché determino un’errato accoppiamento delle basi;
. perché faccio incorporare analoghi di basi.

1) Mutageni chimici (DNA preformato):
--> Su DNA ds (double strand)
Acido nitroso.
Agisce sulla Citosina, quindi in funzione della [HNO3] un po’ di citosine verranno deaminate. Una citosina deaminata diventa un uracile, che durante la sintesi del DNA si appaierà all’Adenina anziché alla Guanosina. Successivamente la U viene eliminata (sistema di riparo che idrolizza le U). Il risultato finale è una transizione CG --> AT.
L’ac, nitroso ha lo stesso effetto sull’Adenina che, deaminata, diventa Ipoxantina che nella synth si appaierà alla C. Il risultato finale è una transizione AT --> GC.
Idrossilammina.
Idrossila la C a T, che si appaierà con la A. Su DNA ss (single strand)
Bisolfito di Sodio.
Il bisolfito deamina la C a Uracile. Una volta che il mio gene che clonato in un certo vettore (M13), questo DNA viene trattato col bisolfito, alla fine ho una mix random di plasmidi single strand con le U al posto delle C, in varie posizioni, sia sul gene che sul resto del plasmide (ori o amp compresi casualmente). A questo punto io costruisco un primer complementare ad una certa zona del plasmide (un oligo), se è complemetare si appaia, e se io aggiungo una polimerasi (we we suggest Klenow che non ha attivitàvtà eso) e aggiungo pure nucleotidi, la pol sintetizza il secondo strand, cosìcché vengono inserite A tutte le volte che sullo stampo cìè la U. Ora che faccio? aggiungo la ligasi per chiudere il nick che sarà rimasto alla fine della polimerizzazione da parte della Klenow. Ora c’è un problema: ho trattato casualmente, quindi è probabile che ori o amp siano danneggiati. Questo mi causa un crollo delle probabilità che il plasmide si replichi naturalmente in Coli. Per cui excido il gene con enzimi di restrizione (tanto so quali usare, spero che il bisolfito non li abbia toccati e, in ogni caso, non sarò andato a scegliere enzimi con siti di riconoscimento ricchi in GC come Sma, ma userò x es. Hind o Eco). Una volta che ho exciso questi geni modificati, li riclono sempre in vitro, in un plasmide opportuno tagliato con Hind e Eco, e uso questo plasmide per trasformare E.Coli. Il plasmide verrà introdotto, c’è un sistema di riparo che riconosce le U e le cancella, solo l’altra elica si replicherà, e avrò quindi un mix di plasmidi ricombinanti. Avrò un alto numero di trasformanti, e quindi dovrò avere un veloce sistema di screening.
Nota: il 2° strand lo faccio perché gli enzimi di restrizione sul ss non funzicano.

2) Incorporazione di analoghi.
In questo caso io non ho il mio gene isolato e clonato, ma sto sintetizzando del DNA con le polimerasi opportune. Invece di aggiungo i normali nucleotidi, aggiungo idrossi-citidina-trifosfato (HO–CTP) al posto della C. Questo roba si può appaiare sia alla G, ma anche alla A, se questo succede avrò una transizione CG-->TA.

3) Errato accoppiamento di basi.
L’abbiamo visto un po’ con la PCR: se io faccio avvenire questo tipo di reazione in modo non corretto, usando o concentrazini sbilanciate di nucleotidi, oppure metto Cobalto o Berillio al posto del Magnesio, avrò condizioni che causano erato accoppiamento fra le basi, e quindi errori (anche col manganese).
Posso anche mettere una grande [Mn++]
Posso pure utilizzare enzimi di polimerasi che mancano di attività proof-reading (Taq), e sappiamo che ogni tanto le polimerasi ci infilano un errore. Se faccio unalto numero di cicli la probabilità di ottenere errore aumenta, quindi alla fine avrò del DNA mutagenizzato (sempre casualmente).
Dovrò poi riclonarlo, trasformare ed avere un saggio di selezione.
Il limite è che è difficile ottenere plasmidi con una singola sostituzione: ce ne sono di più e questo aumenta i tempi di analisi di mutanti e il dispendio di energie.