Alla ricerca del consolidamento del potere in tutta la Toscana il Duca Cosimo I dei Medici perseguì per tutto il suo lungo dominio una politica promozionale fatta di grandi opere pubbliche, tra le quali l'edilizia militare, ovviamente, godé di un'assoluta priorità. In quel periodo vennero realizzate o rafforzate molte delle numerose fortezze che ancor'oggi presidiano i territori di quello che fu il Granducato di Toscana. Protagonisti di così grandi imprese furono, tra gli altri, Antonio e Giuliano da Sangallo, Giovanbattista Bellucci e Bernardo Buontalenti. Quest'ultimi due furono tra gli architetti più qualificati in questo settore e, in tempi e con soluzioni diverse, gli artefici dell'intervento rinascimentale sul vecchio fortilizio pistoiese. Una tradizione popolare, accolta dalla storiografia locale, vuole che in epoca medioevale la fortezza, realizzata dai fiorentini nella prima metà del XIV secolo quando la città stava ricostruendo le sue mura, avesse il nome di S. Barnaba per essere vicina ad una cappella dedicata a questo Santo. Fu intitolata a Santa Barbara soltanto in tempi successivi. Durante il periodo rinascimentale il fortilizio subì un primo ampliamento la cui direzione dei lavori fu affidata al Bellucci, al tempo impegnato nel recupero dell'intero sistema difensivo della città. All'origine dell'intervento bellucciano era il progetto dell'architetto Nanni Unghero che aveva previsto una struttura, a pianta quadrilatera con bastioni ai quattro angoli, priva di ogni decorazione e con un profondo fossato tutt'attorno. Successivamente Bernardo Buontalenti inglobò questo nucleo in un nuovo baluardo collegato alle mura urbane conferendo in tal modo alla fortezza quell'imponente aspetto che tutt'oggi conserva. In tutta la sua storia la fortezza ha subito un solo assedio alla metà del XVII secolo, quando le truppe pontificie attaccarono Pistoia ma furono respinte dai suoi potenti bastioni. Alla fine del Settecento il Granduca Pietro Leopoldo nell'ambito della sua vasta opera riformatrice decise il disarmo della fortezza. Perduto in quell'occasione il suo ruolo di baluardo posto a difesa della città, il fortilizio ha comunque mantenuto una funzione militare, prima come caserma, poi come carcere e distretto.

«…I Fiorentini feciono fare in Pistoia uno castello in su le mura di porta San Pietro, alle spese del Comune di Pistoia, e facean alle spese loro, e ressono la città grande tempo in buono stato e in gran pace e se non fosse lo castello che vi feciono fare e ‘l modo che teneano a signoreggiare la città, li Pistolesi non sarebbero stati tanto in pace che l’uno non avesse cacciato l’altro per le sette e divisioni loro…».  In questo modo nelle Historie Pistoresi si racconta delle origini della fortezza di San Barnaba. Nel 1334 il Comune di Pistoia acquistò i terreni e le case da abbattere poste nell’area del Borgo di Santa Maria nuova fra la porta di San Pietro e la via del Nemoreto, per costruire il nuovo fortilizio. La fortezza di San Barnaba fu costruita in breve tempo. Aveva forma trapezoidale e racchiudeva una piccola area. La cortina perimetrale aveva un’elevazione di 8,50 m dall’antico piano di calpestio. Se consideriamo pure l’altezza del parapetto e dei merli possiamo ipotizzare un’altezza complessiva di circa 10 m. Lo spessore dei muri perimetrali è di 108 cm, essi sono costituiti da ciottoli di fiume murati con calce aerea, giallastra, di bassa consistenza e con grande quantità di inerti di ghiaia di fiume di piccola pezzatura. Lungo il perimetro un fossato alimentato dal rifiuto della gora di Gora proteggeva la struttura difensiva.
Sulla sommità dei muri di cortina vi era un ampliamento verso l’interno impostato su beccatelli di foggia triangolare sormontati da archetti a sesto acuto in mattoni. In questo modo il percorso di ronda era abbastanza largo da permettere il passaggio di due armati. Questa soluzione di ampliamento verso l’interno non era molto comune. Lungo la cortina si ergevano due torri angolari con le porte, una a nord-est e l’altra a sud-ovest, due torrioni mastio, uno al centro del lato di sud-ovest che guarda Firenze, e l’altro che si apre lungo il lato opposto al primo che guarda Pistoia, e una garitta angolare di pianta circolare all’angolo di sud-est.

Di questa prima fortezza abbiamo avuto conoscenze vaghe e incerte per molto tempo. Si è ritenuto che fosse intitolata a santa Barbara da sempre e i rari accenni a san Barnaba sono stati liquidati frettolosamente. Eppure la testimonianza del Fioravanti era inequivocabile nel raccontare che «…in questi tempi passasse per la città di Pistoia san Barnaba Apostolo, e ancora spargesse nella medesima i semi della eterna verità; lo che ci fa pensare quale, e quanto fosse il conforto nei nuovi Cristiani; ed è comune opinione, autorizzata da tradizione assai volgata, che la casa ove egli dimorò fosse ridotta a forma di Cappella, o Chiesetta, la quale al di lui nome dedicata, desse la denominazione al Castello, o Fortezza, che i Fiorentini l’anno 1331 edificarono contigua col nome di San Barnaba posta tra levante, e mezzo giorno vicina alle mura sopra il terreno della Porta di San Pietro in cura a Santa Maria Nuova…».  A conferma del racconto del Fioravanti vi sono le ripetute testimonianze d’archivio relative alla nomina di castellani per il «…castro dicto Barnaba sita in civitas pistorii…». La cappella o chiesetta di San Barnaba oggi non è riconoscibile, si può solo ipotizzare che fosse uno dei locali all’interno del fortilizio oggi adibito ad altro uso.  Analogamente per molto tempo si è creduto che la prima fortezza fosse stata distrutta dai Pistoiesi nel 1343, in occasione della cacciata del Duca d’Atene da Firenze. È ancora la narrazione del Fioravanti ad avvalorare la tesi della distruzione, infatti la fortezza «…fu poi da’ Pistojesi fazionari fino [dai] fondamenti spianata…». Ma anche il Salvi, qualche decennio prima del Fioravanti aveva scritto che i Pistoiesi «…ottenuto il detto castello, subito lo disfecero, anzi fino da’ fondamenti lo spianarono…». La ricognizione della struttura muraria inglobata nell’attuale fortezza smentisce il racconto dei due eruditi che, probabilmente, intendevano solo accentuare l’aspetto campanilistico a discapito della narrazione storica. Peraltro, i documenti d’archivio testimoniano della nomina dei Castellani della fortezza fra il 1338 e il 1370, essi avevano il compito di provvedere a tutte le necessità e agli approvvigionamenti. In questo modo diviene più evidente l’inesattezza del racconto del Fioravanti e del Salvi, mentre è confermato quanto si osserva nella struttura muraria.

La costruzione della terza cinta muraria fu avviata probabilmente poco dopo l’acquisto di casamenti e terreni da spianare per far posto alla fortezza nel quartiere di Santa Maria Nuova. La nuove mura racchiusero un’area doppia di quella della seconda cinta includendo sia i borghi che si erano sviluppati lungo gli accessi principali alla città, sia i monasteri degli ordini mendicanti che erano sorti negli ultimi due secoli. Oltre all’edificazione delle mura fu pure deviato per l’ultima volta il percorso del torrente Brana. I lavori ebbero varie fasi: una prima, molto rapida, alla fine della quale le mura dovevano essere state, sia pure sommariamente, completate, come sembrano suggerire alcuni documenti d’archivio a proposito della custodia diurna e notturna delle porte della città; mentre per lungo tempo proseguirono i lavori di ristrutturazione e modificazione, in particolare nei tratti prossimi agli angoli. Abbiamo notizia di interventi ancora nel 1375 e possiamo ipotizzare che essi si riferissero alle trasformazioni eseguite per saldare le mura della città alla fortezza di San Barnaba. Questa terza cerchia muraria fu realizzata con ciottoli di fiume e calce aerea, la sezione delle mura è di poco superiore al metro e, nello spessore, è ricavato, in sommità, il camminamento di ronda con lo spalto munito di merli che furono demoliti, nel 1544, nel corso dei lavori per la seconda fortezza diretti dal Sanmarino. La cortina muraria si congiunse con il fortilizio in prossimità e a ridosso delle due torri laterali. Sono ancora visibili le tracce sia sulla torre di nord-est, sia su quella di sud-ovest dove, peraltro, sono evidenti i segni di un tamponamento eseguito nel Quattrocento quando il fortilizio fu staccato dalle mura. La saldatura ebbe come conseguenza la necessità di passare attraverso la fortezza per poter entrare o uscire dalla città per cui, poco dopo, si provvide ad aprire una nuova porta, a fianco della fortezza, che si apre su Sant’Agostino. Di essa abbiamo testimonianza dal passaggio di 80 soldati inviati da Firenze a Pistoia nel 1371. Sul finire del Trecento quindi Pistoia ebbe il nuovo perimetro saldato alla fortezza con le rispettive porte principali e le postierle. Il perimetro della cinta muraria andava così a definire lo spazio urbano che, salvo le aggiunte del Cinquecento, sarebbe rimasto pressoché intatto fino agli inizi del Novecento.