4b. Studio della polarizzazione di membrane cellulari
(6)In questo lavoro è stata utilizzata una sonda lipofila chiamata Laurdan per studiare le proprietà chimico-fisiche delle membrane cellulari. Il carattere lipofilo di Laurdan permette una facile integrazione nelle membrane cellulari per semplice incubazione (30min.), nel caso specifico sono stati usati fibroblasti di topo. La resa quantica di Laurdan è molto più alta nelle membrane che in soluzione acquosa (ciò le conferisce la capacità di mettere in risalto al microscopio le strutture membranose), e anche all’interno delle membrane si comporta diversamente in base allo stato in cui la membrana si trova (solido molto ordinato, simile a un gel, sotto la temperatura di transizione o cristallo liquido, ordinato in una sola direzione, sopra la temperatura di transizione), poiché nei vari casi risente della dinamica dei dipoli di solvente all’interfaccia fosfolipidica, cioè di come questi si orientano (processo di rilassamento) rispetto a se stessa, mentre Laurdan si trova nello stato eccitato. Tutto questo in via di principio potrebbe essere studiato grazie all’uso di luce polarizzata, eventualmente risolta nel tempo, ma in questo caso è fondamentale anche l’orientamento relativo del fluoroforo, che nelle cellule non può essere controllato; inoltre i microscopi ottici presentano molti artefatti di depolarizzazione, dovuti soprattutto alla torbidità dei campioni biologici e al conseguente scattering. Tutto questo può essere superato definendo la polarizzazione generalizzata (GP):
GP = (Ib – Ir)/( Ib + Ir)
dove Ib e Ir sono rispettivamente la massima intensità di fluorescenza caratteristica delle fasi di gel (440nm) e di liquido cristallino (490nm); ovviamente deve essere -1<GP<1 (
fig. 4b-1). In realtà quindi questa grandezza non richiede misure in luce polarizzata. Dal valore di GP si possono calcolare le frazioni dei due diversi stati presenti nella membrana in esame. Un alto valore di GP è associato a membrane a bassa fluidità e alto contenuto di colesterolo, e viceversa. Lo strumento utilizzato (fig. 4b-2) è basato sulla tecnica di eccitazione a due fotoni, che risulta molto vantaggiosa associata all’uso di Laurdan, poiché questa è molto sensibile al photobleaching, che è molto ridotto con questa tecnica.Dalle immagini di intensità di fluorescenza alle due lunghezze d’onda, riportate in
figura 4b-3, è evidente che la distribuzione di Laurdan non è uniforme, ma concentrata nelle aree intorno ai nuclei, corrispondenti a strutture membranose quali reticolo endoplasmatico e apparato del Golgi, o per trasporto attivo o per diffusione passiva. Il fenomeno dell’autofluorescenza è significativo a queste lunghezze d’onda, per cui in tutte le immagini riportate è stata sottratta l’intensità media di autofluorescenza misurata per la stessa cellula. Dalle immagini in figura 4b-4 che riportano le mappe di GP per le stesse cellule si può notare che anche la distribuzione di GP non è uniforme, i valori hanno infatti la distribuzione riportata in figura 4b-5. In particolare la seconda e la terza riga di immagini in figura 4b-4 mostrano le stesse immagini della prima riga separate per via digitale, questo procedimento mostra chiaramente come alti valori di GP sono principalmente associati alla membrana plasmatica, che delimita il confine della cellula, mentre i valori più bassi sono caratteristici dell’involucro nucleare, che delimita il nucleo, e delle strutture membranose interne alla cellula, con una ulteriore distribuzione all’interno dei vari tipi di membrana, probabilmente dovuta alla coesistenza di diverse fasi lipidiche. Queste osservazioni sono in accordo con altri dati sperimentali, che associano alla membrana plasmatica una maggiore concentrazione di colesterolo rispetto a quella nucleare, e anche in questo caso si nota un netto contrasto con le immagini di intensità di fluorescenza, che in alcuni casi sono in correlazione positiva e in altri casi in correlazione negativa rispetto a GP. Infatti l’intensità di fluorescenza dipende strettamente dalla concentrazione della sonda, mentre GP risulta una proprietà intrinseca dello stato di fase lipidica. In figura 4b-6 sono riportate alcune immagini GP di diversi piani di una singola cellula, che dimostrano la capacità di risoluzione in 3D. In figura 4b-7 sono invece riportati i risultati di misurazioni di fluorescenza risolta nel tempo, e si può notare chiaramente come i domini con valori alti e bassi di tempi di decadimento sono ancora una volta in netto contrasto con quelli di intensità, mentre corrispondono piuttosto bene con quelli di GP; del resto sono anche molto simili le distribuzioni dei valori (fig. 4b-7 e fig. 4b-5). In particolare si può notare come le regioni corrispondenti alla membrana plasmatica presentano bassa intensità, mentre hanno tempi di rilassamento lunghi, in accordo con l’idea di una maggior rigidità e in corrispondenza ad alti valori di GP, ipotizzando che all’interno delle membrane i fenomeni di quenching siano trascurabili.