4a. Determinazione della concentrazione di ossigeno molecolare nelle cellule in vivo
(5)O2 è un noto quencher, per cui è possibile pensare di introdurre una opportuna sonda fluorescente in una cellula viva e determinare la concentrazione di ossigeno molecolare in base alla sua azione di quenching sulla fluorescenza della sonda. In questo caso è stato usato un microscopio in grado di eseguire misure di fluorescenza risolta nel tempo, abbinato ad un meccanismo di scansione a due fotoni (
fig. 4a-1). La maggiore difficoltà sta nella scelta di una sonda opportuna, per cui questo lavoro è ancora preliminare e con le sonde utilizzate ancora non è possibile determinare con esattezza la concentrazione di O2. In particolare utilizzando benzo[ghi]perylene (sia incubato che elettroporato) è stato necessario sottrarre l’autofluorescenza delle cellule, non trascurabile alla lunghezza d’onda utilizzata, misurata su cellule di controllo non trattate con la sonda. Ovviamente a un aumento della concentrazione di O2 corrisponde una diminuzione dei tempi di decadimento, come si può facilmente constatare dal confronto tra soluzioni di fluoroforo deossigenate e equilibrate con aria (tab. 4a-1). Anche nelle cellule in vivo si notano zone con tempi di decadimento molto più bassi della media, sia quando si usa benzo[ghi]perylene che quando si utilizza acido butirrico di pirene, e si pensa che queste zone corrispondano a cluster di mitocondri. La cosa più interessante è che in entrambi i casi l’intensità di fluorescenza fornisce un risultato diametralmente opposto, mostrando regioni più luminose nelle stesse zone, probabilmente a causa di un accumulo di fluoroforo in queste regioni. Il caso più eclatante è quello del acido butirrico di pirene, in quanto nell’immagine di intensità si evidenzia molto bene una zona particolarmente luminosa (fig. 4a-2), a cui corrisponde un valore di modulazione più alto della media (fig. 4a-3) e un valore di fase più basso della media (fig. 4a-4), che corrispondono entrambi a tempi di decadimento più brevi. Tutte le scale di colori indicano valori della grandezza in esame che crescono da sinistra a destra.