28° Congresso nazionale della Società Italiana di Microbiologia, 19-22 Ottobre 2000, Jesi (AN), Centro Congressi Federico II

Candida dubliniensis, un nuovo patogeno del cavo orale: i primi isolamenti italiani G.M. Giammanco, G. Pizzo, S. Pecorella, M.E. Milici

Dipartimento di Igiene e Microbiologia "G. D'Alessandro", Università degli Studi di Palermo, via del Vespro 133, 90127 Palermo

Candida albicans è generalmente riconosciuta come la specie maggiormente patogena fra quelle appartenenti al genere Candida e, ancora oggi, è la più frequentemente implicata nelle affezioni orali sia in soggetti immunocompromessi che immunocompetenti. Tuttavia, negli ultimi dieci anni, l’incidenza di infezioni da C. albicans è diminuita in rapporto a quelle causate da altre specie dello stesso genere, come C. tropicalis, C. glabrata, e C. krusei. In questo cambiamento del quadro epidemiologico sembra iscriversi anche la recente comparsa di un nuovo patogeno opportunista del cavo orale: Candida dubliniensis.

In realtà, il primo isolamento di quella che oggi è conosciuta come C. dubliniensis risale addirittura al 1957 e venne effettuato in Gran Bretagna da un prelievo autoptico di tessuto polmonare effettuato su un soggetto deceduto a seguito di una broncopolmonite (Sullivan et al., 1993, 1995). Tuttavia, all’epoca il ceppo isolato venne erroneamente identificato come C. stellatoidea e, come tale, depositato come ceppo di riferimento nella British National Collection of Pathogenic Fungi (NCPF) sotto il codice NCPF 3108. Il caso volle che Sullivan, Coleman e coll., gli irlandesi artefici della scoperta e della denominazione della nuova specie, utilizzassero questo ceppo di collezione come riferimento nella tipizzazione genetica di ceppi atipici appartenenti al genere Candida (Sullivan et al., 1993). Fu così che ci si accorse della somiglianza del vecchio ceppo clinico degli anni ’50 con una serie di ceppi isolati in Australia, Irlanda e Gran Bretagna alla fine degli anni ’80 ed all’inizio dei ’90 da soggetti HIV-positivi e malati di AIDS. Solo nel 1995, tuttavia, Sullivan, Coleman e coll. proposero che questo gruppo di ceppi, fenotipicamente e genotipicamente correlati, rappresentasse una nuova specie (Sullivan et al., 1995). Per questa nuova specie fu proposto il nome C. dubliniensis, da Dublino, la capitale della Repubblica d’Irlanda, dove la nuova specie era stata identificata come tale.

Da allora molti altri isolamenti clinici di ceppi di C. dubliniensis dal cavo orale di soggetti HIV+ o malati di AIDS sono stati segnalati (punti rossi sulla carta) in Argentina (Sullivan et al., 1997; Rodero et al., 1998), Australia (Sullivan et al., 1997), Belgio (Schoofs et al., 1997; Odds et al., 1998), Brasile (Sano et al., 2000), Canada (Boucher et al., Gene 1996), Francia (Le Guennec et al., 1995), Finlandia (Hannula et al., 1997), Germania (Morschhäuser et al., 1999), Gran Bretagna (Sullivan et al., 1997), Irlanda (Sullivan et al., 1997), Spagna (Diaz-Guerra et al., 1999), Stati Uniti (Salkin et al., 1998; Kirkpatrick et al., 1998), e Svizzera (Boerlin et al., 1995; Sullivan et al., 1997) In Italia, il primo isolamento clinico di C. dubliniensis è stato segnalato a Catania da Giammanco e coll. (Giammanco et al., 2000). Questo primo ceppo italiano di C. dubliniensis è stato ripetutamente isolato dal cavo orale di uno stesso soggetto sieropositivo nel corso di periodici controlli di routine ed in assenza di segni di candidiasi del cavo orale.

La distribuzione geografica di questa specie sembra pressoché ubiquitaria, ed in un recente studio retrospettivo su ceppi clinici precedentemente identificati come C. albicans, è stata ritrovata anche in distretti corporei extra-orali, quali il tratto genitale, gastrointestinale e respiratorio, così come dai soggetti HIV-negativi (Jabra-Rizk et al., 2000). In Israele C. dubliniensis è stata isolata da diversi distretti in soggetti HIV-negativi sottoposti ad antibiotico terapia (Polacheck et al., 2000), ed in Giappone da una ferita chirurgica (Kamei et al., 2000). Il coinvolgimento di tale specie in episodi di candidemia è stato recentemente documentato in alcuni pazienti sottoposti a chemioterapia, defedati o lungodegenti, e in corso di AIDS (Brandt et al., 2000). I dati epidemiologici suggeriscono che, benché essa rientri fra i costituenti della normale flora microbica del cavo orale, C. dubliniensis sia in grado di causare malattia pure in assenza di concomitante infezione da parte di altre specie appartenenti al genere Candida, almeno in soggetti HIV-positivi e malati di AIDS. Il coinvolgimento di C. dubliniensis nelle patologie del cavo orale merita, poi, particolare interesse in quanto alcuni ceppi clinici sono stati trovati resistenti al fluconazolo, un antimicotico fra i più utilizzati, e ceppi sensibili al fluconazolo si sono dimostrati capaci di acquisire rapidamente resistenza a questo farmaco in vitro (Moran et al., 1997) e in vivo (Ruhnke et al., 2000). Dati più abbondanti sull’incidenza e la farmacoresistenza, nonché sul ruolo patogeno di questo germe, sia nei pazienti immunodepressi che nei soggetti immunocompetenti, sarebbero auspicabili per comprenderne la reale importanza. Tuttavia, perché questo sia possibile, è fondamentale che si sia in grado di identificare correttamente C. dubliniensis nei campioni clinici, distinguendola dalle altre specie del genere Candida, ed in particolare C. albicans.

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A conferma delle difficoltà nell’identificare C. dubliniensis al momento dell’isolamento clinico, anche il primo isolamento italiano di è avvenuto casualmente, durante un lavoro di tipizzazione di ceppi di C. albicans isolati dal cavo orale di soggetti HIV+ , grazie al riscontro di una banda anomala nel cariotipo elettroforetico di un gruppo di sei ceppi isolati dallo stesso paziente (Giammanco et al., 2000).

Identificare correttamente C. dubliniensis è reso particolarmente difficile dal fatto che essa condivide con C. albicans alcuni caratteri fenotipici tra cui l’aspetto delle colonie, la morfologia delle blastospore, la formazione di tubuli germinativi in siero e la produzione di clamidospore. Per cui, la valutazione di tali caratteri, ed in particolare il Germ Tube Test (GTT), utilizzato in molti laboratori come unico criterio per l’identificazione presuntiva di C. albicans, non risulta utile nell'identificazione differenziale delle due specie.

Al contrario, la valutazione del colore delle colonie cresciute sul terreno CHROMagar‘ Candida (Becton Dickinson, Meylan, France), risulta efficace nell’identificazione presuntiva di C. dubliniensis anche da campioni clinici con più specie di Candida ed anche in presenza di C. albicans. Le colonie di C. albicans su CHROMagar assumono generalmente un colore verde chiaro, mentre quelle di C. dubliniensis appaiono verde scuro, risultando così facilmente distinguibili dalle colonie formate dalle specie non-albicans, al contrario di quanto avviene con i comuni terreni di isolamento, come il Sabouraud agar.

Dei codici per l'identificazione di C. dubliniensis con i sistemi commerciali API 20C AUX e API ID 32C sono stati recentemente pubblicati (Pincus et al., 1999). L'utilizzo di sistemi commerciali, quali API 20C AUX, permette di ottenere profili identificativi peculiari per la specie C. dubliniensis.

Un protocollo comprendente uno screening delle colonie isolate su CHROMagar in base al loro colore, e il successivo allestimento di test di laboratorio in grado di discriminare fra C. dubliniensis e C. albicans, è stato da noi utilizzato per l’identificazione dei lieviti isolati da tamponi orali provenienti da pazienti HIV+. Tutte le colonie di colore verde chiaro o verde scuro sono state sottoposte a due test, semplici ed economici: la riduzione del trifeniltetrazolio cloruro (TTC) (Velegraki & Logotheti, 1998) e la crescita a 45°C (Pinjon et al., 1998).

L’applicazione di tale protocollo ha permesso di identificare tre ceppi di C. dubliniensis su un totale di 30 ceppi di Candida spp. isolati a Palermo da 17 pazienti HIV+. L’identificazione è stata confermata attraverso la valutazione del profilo di assimilazione dei carboidrati ottenuto con il sistema API 20C AUX. I tre ceppi di C. dubliniensis si sono dimostrati sensibili al fluconazolo (MIC <8 mg/ml; Fungitest, Sanofi-Pasteur, Paris, Francia).

Ceppo	Cod. API 20C AUX a 48 h	Cod. API 20C AUX a 72 h	MIC fluconazolo (mg/ml)
428	2172134	2176174	< 8
356	6172114	6172154	< 8
342	6172134	6176174	< 8

L'identificazione di specie di questi tre isolamenti di C. dubliniensis, così come quella del primo ceppo isolato a Catania, è stata da noi confermata mediante una PCR specifica (Mannarelli & Kurtzman, 1998).

L'applicazione del protocollo di isolamento e identificazione presentato garantisce un razionale approccio diagnostico alle infezioni fungine del cavo orale e costitutisce un requisito metodologico indispensabile per la valutazione del ruolo ricoperto da C. dubliniensis come patogeno opportunista. Nel trattamento degli immunodepressi il tempestivo intervento terapeutico può risultare fondamentale, visto che queste infezioni rappresentano l’impedimento maggiore verso la completa guarigione ed il ritorno ad uno stato di salute del paziente. In questa ottica la precisa e corretta identificazione di questi microrganismi patogeni è un requisito essenziale per gli studi di patogenicità, clinici ed epidemiologici.

BIBLIOGRAFIA

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