Fonti principali di inquinamento idrico:

• Liquami
• Effluenti industriali
• Piogge con il conseguente deflusso superficiale agricolo e urbano
• Agricoltura: uso di fertilizzanti e pesticidi

Nuovi patogeni trasmissibili con l'acqua riconosciuti negli ultimi 25 anni:

• Campylobacter jejuni
• Cryptosporidium parvum
• Legionella pneumophila
• Legionella spp.
• Norwalk-like viruses
• Vibrio vulnificus
• Vibrio parahaemolyticus
• Yersinia enterocolitica

Cryptosporidium

I Cryptosporidium sono dei protozoi parassiti intracellulari che sono recentemente emersi come causa importante di diarrea per l'uomo e per gli animali. La specie di Cryptosporidium patogena per líuomo è Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium è presente nell'ambiente sotto forma oocisti di 5 mm di diametro, contenenti quattro sporozoiti. Gli esseri umani e gli animali si infettano ingerendo queste oocistsi, che raggiunto l'intestino, si rompono, liberando gli sporozoiti. Gli sporozoiti, che sono mobili, aderiscono a ed invadono le cellule epiteliali del tratto gastrointestinale. Il parassita si stabilisce in un vacuolo intracellulare che rigonfia la cellula parassitata e protrude nel lume dell'intestino. Qui, il parassita si moltiplica formando otto merozoiti, che poi fuoriescono dalla cellula ospite, infettano altre cellule circostanti e completano la fase asessuale del ciclo di vita. Ad un certo punto, i merozoiti si differenziano nei gameti, che vanno incontro a riproduzione sessuale all'interno dello stesso ospite per rigenerare infine le oocisti infettanti, che vengono espulse con le feci.

Cryptosporidium è una causa riconosciuta di diarrea, specialmente fra i bambini, in paesi in via di sviluppo. Parecchi studi hanno suggerito che la criptosporidiosi sia più comune in bambini di età inferiore a 1 anno e sia associata con la malnutrizione. Non è, tuttavia, ancora chiaro se i bambini siano predisposti alla criptosporidiosi dalla malnutrizione, se la criptosporidiosi conduca alla malnutrizione, o entrambe. Il meccanismo di questa malattia diarroica è poco chiaro, ma sembra legato al malassorbimento persistente dovuto allíinfiammazione intestinale o ad uníaumentata predisposizione ad infezioni da altri agenti patogeni enterici.

Le epidemie di criptosporidiosi dovute a contaminazione dell'acqua potabile sono sempre più frequenti. Ci sono quattro fattori importanti che contribuiscono a questo incremento:

(a) la prevalenza di Cryptosporidium nell'acqua di fonte è alta;

(b) le oocisti di Cryptosporidium sono refrattarie al trattamento con cloro dellíacqua potabile;

(c) i metodi di filtrazione utilizzati normalmente per le acque potabili di superficie non rimuovono efficientemente le oocisti di Cryptosporidium, a causa del loro piccolo diametro;

(d) la carica infettante di Cryptosporidium per gli esseri umani è estremamente bassa.

Anche se carenze nel trattamento delle acque sono state identificate in alcune epidemie, almeno un'epidemia si è presentata in rapporto con una moderna stazione di trattamento delle acque, in cui il trattamento era ben documentato ed effettuato in maniera corretta. Negli Stati Uniti, il controllo sistematico della presenza di Cryptosporidium nell'acqua potabile è obbligatorio per tutti gli impianti di trattamento e distribuzione che servono una popolazione superiore alle 100.000 persone. Tuttavia, i metodi correnti utilizzati per la ricerca di Cryptosporidium possono sottostimare la presenza del parassita. In avvenire, metodi di analisi più sensibili basati sulla ricerca del DNA del parassita possono facilitare la rilevazione di Cryptosporidium nei campioni ambientali.

La diagnosi di criptosporidiosi si basa sull'identificazione microscopica delle oocisti nelle feci o delle forme intracellulari in campioni di biopsia della mucosa gastrointestinale. Test di verifica morfologica rigorosi devono essere applicati per evitare la confusione con altre oocisti, quali quelle di Cyclospora, che sono significativamente più grandi (10 mm). Mentre questo tipo di analisi è solitamente sufficiente per diagnosticare la malattia in pazienti sintomatici che stanno espellendo miliardi di oocisti, una maggiore sensibilità è indispensabile quando si vogliono esaminare individui asintomatici o campioni ambientali.

Metodi immunologici
Diversi kit di analisi in immunofluorescenza (IFA) ed in immunoenzimatica (EIAs) sono disponibili in commercio per la rilevazione di Cryptosporidium in feci e campioni ambientali. Tuttavia, entrambi gli esami hanno mostrato una certa reattività crociata per le oocisti di Cryptosporidium non-parvum. Mentre tale reattività crociata non è probabilmente significativa nei campioni clinici, essa può portare ad identificare erroneamente specie di Cryptosporidium che sono agenti patogeni non-umani e che sono frequentemente presenti nei campioni ambientali.

PCR
La rilevazione di Cryptosporidium mediante polymerase chain reaction (PCR ) è attraente per la elevata sensibilità e per la estrema specificità. Inoltre, le informazioni genetiche ottenute dal campione possono consentire di distinguere gli agenti patogeni non-umani da quelli umani. Parecchi sistemi di rilevazione mediante PCR per Cryptosporidium in campioni clinici ed acqua potabile sono stati pubblicati. Alcuni ricercatori hanno dimostrato una sensibilità estremamente elevata delle analisi in PCR (una singola oocisti).

Legionella

Le Legionellae sono batteri gram-negativi che hanno il loro habitat nell'acqua dolce. I primi ceppi di Legionella sono stati isolati nel 1943 da Tatlock, e nel 1947 da Jackson. Il genere Legionella è stato stabilito nel 1979, 3 anni dopo un grande epidemia di polmonite verificatasi fra i membri della legione americana, che fu attribuita ad un batterio fino ad allora sconosciuto, Legionella pneumophila. Le Legionellae sono parassiti intracellulari dei protozoi d'acqua dolce ed usano un meccanismo simile per moltiplicarsi all'interno delle cellule di mammiferi.

Questi batteri causano una malattia respiratoria nell'uomo quando un ospite suscettibile inala aerosol o aspira acqua contaminata. La malattia che ne deriva, la legionellosi, classicamente si presenta come due entità cliniche distinte, la malattia dei Legionari, una malattia severa multisistemica che comprende la polmonite, e la febbre di Pontiac, una malattia auto-limitante simil-influenzale. Inoltre, in molte persone líinfezione avviene in forma assolutamente asintomatica. Non è possibile distinguere clinicamente la malattia dei Legionari da altri tipi di polmoniti, anche se all'esame radiografico del torace gli infiltrati alveolari sono più comuni con la malattia di Legionari. La certezza diagnostica si ottiene solo con la dimostrazione della presenza del microrganismo nei campioni clinici.
Una sola specie di Legionella, L.pneumophila, causa circa il 90% di tutti i casi di legionellosi segnalati negli Stati Uniti. Questa cifra può risultare gonfiata poiché la maggior parte delle prove diagnostiche sono specifiche per L.pneumophila. Attualmente, nel genere Legionella esistono 48 specie che contengono 70 sierogruppi distinti. Fra i 15 sierogruppi di L.pneumophila, il 79% di tutti i casi confermati è dovuto al sierogruppo 1. Circa la metà delle 48 specie di legionellae è stato associato con la malattia umana. Poiché tutte le legionellae sono ritenute capaci di sviluppo intracellulare nella cellula ospite, è probabile che la maggior parte di esse possa causare la malattia umana nelle circostanze adatte. Le infezioni dovute ai ceppi meno comuni di Legionella sono segnalate raramente anche a causa della mancanza di test diagnostici specifici. Eí stato valutato che fra 8.000 e 18.000 persone sono ospedalizzati annualmente per legionellosi negli Stati Uniti. Questa malattia è una importante preoccupazione per le autorità di sanità pubblica e per coloro che sono coinvolti nella costruzione e nella gestione di sistemi idrici. La legionellosi è generalmente considerata una malattia prevenibile perché controllare o eliminare il batterio in determinati serbatoi impedirà il verificarsi della malattia. Questo concetto della malattia prevenibile ha portato alla produzione di un certo numero di linee guida di riferimento per la costruzione dei sistemi idrici e di nuove strategie di controllo che puntano alla riduzione del rischio di legionellosi. I fattori che conducono al verificarsi di epidemie di legionellosi non sono ancora completamente compresi, ma determinati eventi sono considerati requisiti preliminari per l'infezione.

Questi includono:

(a) la presenza del batterio in un ambiente acquatico,

(b) la possibilità per il batterio di moltiplicarsi fino a raggiungere la carica infettante necessaria,

(c) la trasmissione dei batteri via aerosol ad un ospite umano suscettibile all'infezione.

L'acqua è il serbatoio principale per le legionelle e questi batteri sono trovati in ambienti acquatici in tutto il mondo. Legionellae sono state ritrovate nel 40% degli ambienti d'acqua dolce esaminati con tecniche colturali e fino allí 80% utilizzando la PCR. Una singola eccezione a questa osservazione è Legionella longbeachae, che è stata frequentemente isolata dal terreno da giardinaggio. Questa specie è la causa principale di legionellosi in Australia e si presenta in giardinieri ed in soggetti esposti al terreno commerciale.
L.pneumophila si moltiplica a temperature comprese fra 25 e 42°C, con una temperatura ottimale di sviluppo di 35°C. La maggior parte dei casi di legionellosi possono essere collegati ad ambienti acquatici artificiali in cui la temperatura dell'acqua è superiore alla temperatura ambientale. Gli ambienti acquatici termicamente alterati possono spostare l'equilibrio fra i protozoi ed i batteri, con conseguente rapida moltiplicazione di legionellae, che possono tradursi in casi di malattia umana. La legionellosi è una malattia che è emersa nell'ultima metà del ventesimo secolo a causa dell'alterazione umana dell'ambiente. Se lasciata nella sua condizione naturale, la legionella sarebbe una causa estremamente rara di malattia umana, poichè gli ambienti d'acqua dolce naturali non sono mai stati implicati come serbatoi di epidemie di legionellosi.

La presenza dei batteri nellíambiente acquatico e la temperatura dell'acqua sono due fattori che possono aumentare il rischio di malattia dei Legionari. Un terzo componente indispensabile è la presenza dei fattori nutrizionali che permettono ai batteri di moltiplicarsi. Questi batteri richiedono una combinazione particolare di sostanze nutrienti per svilupparsi in laboratorio. Inizialmente, questi requisiti nutrizionali insoliti sono sembrati contraddire la distribuzione diffusa delle legionelle negli ambienti d'acqua dolce. I livelli di sostanze nutrienti che le legionelle richiedono si trovano raramente nellíacqua dolce e, se presenti, farebbero soltanto moltiplicare i batteri a crescita più rapida rispetto alle legionelle. Tuttavia, queste sostanze nutrienti sono presenti nellíambiente intracellulare. Le legionelle sopravvivono negli ambienti acquatici e nel terreno umido come parassiti intracellulari dei protozoi. Questi batteri sono in grado di moltiplicarsi in 14 specie di amebe, due specie di protozoi ciliati ed una specie di fungo del fango. In particolare, le legionelle sopravvivono bene all'interno di biofilms nei sistemi di distribuzione dellíacqua.

La diagnosi. Il metodo colturale resta lo standard di riferimento per la diagnosi di legionellosi ed è la procedura diagnostica più specifica. Tuttavia, un certo numero di fattori limitano la sensibilità della coltura. In primo luogo, pochi laboratori sono attrezzati ed esperti nell'isolamento delle legionelle. Un'indagine dei microbiologi americani ha dimostrato che ben due terzi dei laboratori clinici di microbiologia negli Stati Uniti non sono in grado di far crescere una coltura di L.pneumophila. Inoltre, questi batteri sopravvivono per breve tempo nelle secrezioni respiratorie, e la semina immediata di questi campioni è importantissima. La sensibilità dellíisolamento colturale dalle secrezioni respiratorie varia ampiamente, (dal 20 allí80%), riflettendo la natura deteriorabile di questi esemplari e la perizia richiesta per líisolamento.

Colonie di L. pneumophila su charcoal yeast extract agar

L'esame microscopico dei campioni dopo colorazione con anticorpi fluorescenti specifici (direct fluorescent antibody = DFA) è stato il primo metodo impiegato per rilevare la presenza di legionelle nel tessuto polmonare e nelle secrezioni respiratorie. Il metodo DFA inoltre può essere usato per la tipizzazione sierologica degli isolati di Legionella. Un numero limitato di sieri policlonali coniugati con fluorescina è disponibile per riconoscere i sierogruppi di L. pneumophila e le specie di L. non-pneumophila. La specificità e la sensibilità di questi reagenti non sono state ancora ben valutate, ma sono state segnalate reazioni crociate con batteri non-Legionella.

Ricerca dell'acido nucleico di Legionella. La prima analisi progettata per rilevare la presenza di DNA di L. pneumophila era basata sullíutilizzo di una sonda radioattiva specifica per il DNA ribosomico, comune a tutte le specie di Legionella. Studi successivi hanno segnalato la scarsa specificità di questa analisi ed il kit diagnostico che la impiegava è stato ritirato dal mercato. La PCR rappresenta uno dei pochi test diagnostici in grado di rilevare le infezioni causate da tutte le specie conosciute di Legionella. Tuttavia, la maggior parte dei kit in commercio rilevano soltanto le infezioni dovute al sierogruppo 1 di L. pneumophila. I diversi kit di PCR che sono stati sviluppati per legionella utilizzano come sequenze bersaglio, il gene per lírRNA 5S, il gene per lírRNA 16S, o il gene di mip. Uno dei kit più ampiamente usati per rilevare la presenza di legionelle nell'ambiente (kit EnviroAmp; Perkin-Elmer, Inc., Norwalk, Connett.), amplifica simultaneamente due bersagli, un bersaglio nellírRNA 5S specifico per il genere di Legionella e una parte del gene di mip specifica per L.pneumophila. tuttavia anche questo kit è stato ritirato dal mercato nel 1997 a causa della sua scarsa sensibilità, nonostante un'alta specificità. Altre analisi in PCR che utilizzano come gene bersaglio lírDNA 16S si sono dimostrate altamente sensibili e specifiche. Tuttavia, un certo numero di risultati falso-positivi sono stati ottenuti con specie di Acinetobacter e con un Proteobacterium non identificato e con specie appartenenti al genere Gemella.

METODI DIAGNOSTICI INNOVATIVI PER LA RICERCA DI MICRORGANISMI PATOGENI NELLE ACQUE

Identificazione dei batteri ambientali mediante amplificazione ed analisi del 16S rDNA.

I metodi colturali convenzionali impiegati per determinare la composizione delle comunità microbiche sono lenti e possono evidenziare soltanto quella frazione dei microrganismi che sono in grado di svilupparsi sui comuni terreni di coltura utilizzati. Un'alternativa è rappresentata da una combinazione di tecniche molecolari in grado di caratterizzare e confrontare esattamente i componenti delle comunità microbiche recuperate dalla superficie di una membrana di filtrazione del campione di acqua. Questa tecnica è basata sull'amplificazione tramite PCR della regione ipervariabile 16S del gene dellíRNA ribosomico (rRNA 16S) (figura 1), seguita dalla separazione automatizzata di questi prodotti amplificati usando la reverse-phase ion-pair high performance liquid chromatography (HPLC Rp-IP). I prodotti di PCR separati vengono identificati mediante sequenziamento o analisi del profilo di restrizione attraverso un pacchetto di programmi su misura in grado di confrontare i profili di restrizione con le sequenze depositate nel Ribosomal Database Project (RDP) (figura 2).

Figura 1. Passaggi fondamentali nella caratterizzazione del biofilm di una membrana di filtrazione tramite líanalisi del 16s rRNA.

Figura 2. Laboratorio di biologia molecolare: Estrattore di DNA, Sequenziatore e Amplificatore.

Líanalisi del gene che codifica per lírRNA 16S è molto adatta per líidentificazione e la descrizione delle comunità microbiche ambientali perché questo gene si ritrova in tutte le specie batteriche, poiché la sua funzione fondamentale per le sintesi proteiche deve essere conservata nellíevoluzione, è facile da sequenziare poiché non è troppo lungo, e una grande banca dati, il Ribosomal Database Project (RDP), è disponibile per l'allineamento e l'identificazione delle sequenze. Questo metodo prevede líestrazione del DNA totale dal campione e líamplificazione della regione più variabile del gene 16S, utilizzando dei primer che si legano specificamente alla maggior parte degli eubacteria (figura 3).

Figura 3. I due domini maggiori in cui vengono raggruppati i microrganismi procarioti determinati mediante analisi dellírRNA 16S.

Il risultato dell'amplificazione tramite PCR della regione di 500 paia di basi del gene del 16S rRNA è indicato nella figura 4 per quattro campioni ambientali. Una o più bande nel gel di agarosio indicano la presenza di uno o più organismi in ciascuno dei campioni, ma non forniscono alcuna informazione per quanto riguarda l'identità degli organismi presenti.

Figura 4. Amplificazione mediante PCR del DNA totale estratto da 4 diversi campioni ambientali. La migrazione in gel di agarosio indica la presenza di uno o più organismi in ognuno dei 4 campioni, ma non da informazioni riguardo la loro identità.

I diversi ampliconi devono essere separati per identificarli. Questo può essere realizzato facilmente usando il WAVE DNA Fragment Analysis System che usa la reverse-phase ion-pair high performance liquid chromatography (HPLC Rp-IP) per separare velocemente i frammenti di DNA. I frammenti del DNA sono separati in base alla taglia e alla loro temperatura di denaturazione che dipende dalle caratteristiche della sequenza (figura 5). I frammenti separati vengono raccolti mediante eluizione dalla colonna cromatografica per mezzo di una micro campionatrice automatica che recupera l'eluente della colonna che corrisponde a ciascuno dei picchi registrati nel cromatogramma. Questo strumento unisce una alta sensibilità (fino ad una risoluzione di una sola variazione di base nucleotidica nella sequenza) alla necessità di una analisi veloce. Un ciclo di separazione con questo sistema si completa in circa sette minuti.

Figura 5. Separazione dei prodotti amplificati da un campione misto usando la RP-IP HPLC. I singoli ampliconi vengono isolati fisicamente dalla mistura utilizzando un collettore per recuperare dalla colonna líeluente che corrisponde a ogni picco rilevato.

L'esatta identità di ciascuna delle sequenze 16S ipervariabili amplificate mediante PCR viene poi determinata o mediante analisi del polimorfismo nella lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP), o mediante sequenziamento. L'analisi RFLP localizza la posizione dei siti di taglio di determinate endonucleasi (ciascun sito di taglio è costituito da una successione di 4-6 paia di basi e tipicamente si presenta solo una volta allíinterno di un amplicone) per produrre un pattern di bande, una specie di "impronta digitale" che può essere confrontata con una raccolta molto vasta di impronte di diversi microrganismi per identificare líorigine dellíamplicone. L'identificazione dei batteri, al livello di specie, viene fatta paragonando il pattern dei frammenti di restrizione alle sequenze estratte dal ribosomal database (RDP) utilizzando un programma apposito (figura 6).

Figura 6. Rappresentazione schematica della sequenza di eventi nellíanalisi dei profili di restrizione.

Questo metodo presenta il vantaggio della velocità e spesso bastano soltanto sei enzimi per identificare un microrganismo al livello di specie (figura 7).

Figura 7. Electroferogrammi della regione ipervariabile dellíamplicone ottenuto da un isolato ambientale. I prodotti di PCR vengono tagliati con una serie di endonucleasi di restrizione ed i frammenti risultanti vengono separati con un sistema di elettroforesi capillare in base alla taglia. La presenza e la taglia di ogni frammento di restrizione forma il "fingerprint" pattern dal quale si deduce líidentità dellíisolato per confronto con una banca dati di pattern di restrizione.

Se il pattern RFLP non combacia con nessuno di quelli presenti nelle banche dati, o se è richiesta una conferma più rigorosa, è necessario determinare l'intera sequenza di basi dellíamplicone (figura 8). Questo è un metodo più laborioso, ma presenta il vantaggio di rilevare delle differenze molto piccole nella struttura dellíamplicone.

Figura 8. Cromatogramma di una sequenza parziale di un ceppo di E. coli. Il sequenziamento fornisce molte più informazioni rispetto all'analisi dei pattern di restrizione. Esso può essere utilizzato anche per identificare nuovi microrganismi, che non sono compresi nelle banche dati di pattern di restrizione.

Il sequenziamento dei prodotti amplificati separati mediante cromatografia è effettuato tramite l'analizzatore genetico ABI 310. Questo strumento utilizza un sistema di elettroforesi capillare ed un laser per individuare i frammenti di DNA marcati con sostanze fluorescenti. I frammenti sono sequenziati velocemente (> 450 basi con una accuratezza del 98%). Oltre 600 basi possono essere sequenziate in meno di 3 ore. I dati vengono raccolti in un database usando il software di analisi di sequenza dello strumento. Le sequenze vengono poi allineate e l'identificazione è fatta usando la banca dati del ribosomal database project che attualmente contiene le sequenze dellíRNA 16S di circa 8.000 organismi.

Questa combinazione di tecniche molecolari è in grado di determinare velocemente ed esattamente la composizione microbica di un biofilm raschiato dalla superficie di una membrana di filtrazione o proveniente da altri tipi di campioni ambientali. Questi metodi possono essere usati per rilevare e confermare velocemente la presenza di agenti patogeni microbici in campioni ambientali.

Líidentificazione dei batteri mediante DNA-probes.

Líintroduzione di sonde fluorescenti, che possono essere ibridizzate con líintera cellula batterica, oggi permette di individuare al microscopio i microrganismi di cui si va alla ricerca anche in una popolazione mista (Amann et al., 1995). Benché svariati geni siano stati utilizzati come bersaglio sfruttando sequenze gruppo- o ceppo-specifiche, il miglior approccio per differenziare gruppi filogenetici di microrganismi risulta, ancora una volta, líutilizzo di sonde dirette contro la piccola o la grande subunità dellírRNA. Queste sonde di DNA sono complementari a regioni più o meno conservate la cui scelta dipende dal tipo di dubbio che ci si trova a dover risolvere, la sequenza degli oligonucleotidi ne determinerà la specificità. La sequenza bersaglio deve essere altamente conservata se la sonda è rivolta contro un intero dominio (per esempio Bacteria), mentre la sequenza complementare dovrebbe mostrare un alto grado di variabilità se si vuole individuare una singola specie. Entrambi questi tipi di sequenze possono essere trovati nellírDNA 16S e/o 23S. Sono state individuate e pubblicate sonde specifiche per le cellule procariote (Archaea e Bacteria), per Eucarya, per ognuno dei tre domini, per i batteri Gram-positivi ad alto e basso contenuto di G+C, per generi, gruppi di specie e singole specie o ceppi (Tabella 5).

--------------------------------------------------------------------------------------------------------
Probe Target
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
EUK516 Eucarya
ARCH915 Archea
Eub338 Eubacteria
CF319a+b Cytophaga-Flexibacter
ALF1b Proteobacteria branch a + d + Spirochetales
BET42a Proteobacteria branch b
SRB Proteobacteria branch d
GAM42a Proteobacteria branch g
E Cat* Proteobacteria branch e
HGC * Gram +, high GC
BGC * Gram +, low GC
Cte23a Comamonas
ACA23a Acinetobacter
P72 Pseudomonas
Colinsitu* Escherichia coli
Sal * Salmonella
Y16S69 Yersinia
Ecoccus* Enterococcus
Ecalis* Enterococcus faecalis
LEG705 Legionella
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
Tabella 5. Selezione di sonde a vari livelli di specificità filogenetica reperite in letteratura o messe a punto presso il laboratorio Acquabiolab dellíIstituto Pasteur di Parigi*.

Sonde specifiche possono essere facilmente costruite sulla base del confronto delle sequenze di rDNA disponibili nelle banche dati, ma è sempre opportuno verificare la specificità delle sonde mediante prove di ibridazione con ceppi di riferimento. In effetti, non tutte le porzioni della sequenza dellírRNA sono ugualmente disponibili per líibridazione.


o Fluorescent In situ hybridization (FISH). Questa tecnica si basa sullíutilizzo di sonde specifiche costituite da oligonucleotidi lunghi circa 20 basi, marcati con fluorocromi. Le sonde di oligonucleotidi possono passare attraverso la membrana cellulare batterica, dopo opportuna fissazione e permeabilizzazione, e raggiungere il loro bersaglio, costituito dall' rRNA. Se la sonda trova il suo bersaglio specifico rimarrà legata alla sua sequenza complementare anche dopo la fase di lavaggio e la cellula produrrà il corrispondente segnale fluorescente. Poiché sono presenti circa 30.000 copie di rRNA nel citoplasma di una singola cellula batterica, essa sarà interamente fluorescente (Figura 9).

Figura 9. Bersaglio molecolare delle sonde a DNA nella tecnica FISH.

Per l'ibridazione su cellule intere si usano 25 ng di sonda in soluzione di ibridazione che vengono applicati direttamente sui vetrini o sulle membrane su cui si trovano le cellule fissate. L'ibridazione viene effettuata in condizioni di stringenza (temperatura e concentrazione salina) adeguate alle caratteristiche della sonda e per un tempo compreso fra 1 e 2 ore, se si utilizza solo una sonda, o il doppio, se si utilizzano due sonde con differenti stringenze di ibridazione ottimali. Dopo aver rimosso le sonde non legate con opportuna soluzione di lavaggio (15-20 minuti), il campione può essere osservato con un microscopio ad epifluorescenza. Un diagramma di flusso per líintero trattamento è mostrato in figura 10.

Figura 10. Diagramma di flusso della tecnica FISH.

Molti fluorocromi differenti sono disponibili per marcare le sonde ed ognuno di essi ha la sua specifica lunghezza díonda di eccitazione e di emissione (Figura 11).

Figura 11. Spettri di eccitazione ed emissione del fluorocromo Texas red.

Il microscopio a fluorescenza va equipaggiato con un filtro specifico per il fluorocromo che si intende utilizzare, ma sono anche disponibili filtri a due e tre bande passanti che permettono di visualizzare due o tre fluorocromi diversi nella stessa immagine. Mediante líutilizzo di questi filtri è possibile vedere sulla stessa immagine due o tre specie batteriche ibridate con sonde specifiche (Figura 12).

Figura 12. Popolazione batterica mista di Comamonas acidovorans ed Escherichia coli (ratio 1 : 4000) evidenziata con sonde specifiche.

Un approccio più innovativo viene al momento da noi messo a punto nellíambito del progetto ìAquabiolabî allíIstituto Pasteur di Parigi, sponsorizzato dalla multinazionale Vivendi, per líidentificazione dei batteri in campioni ambientali. Esso si basa sulla analisi spettrale delle immagini per individuare diverse combinazioni di sonde fluorescenti.

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