DNA ricombinante
descrizione tecniche usate per creare cloni batterici mediante la tecnica
del DNA ricombinante
esempio di DNA ricombinante cioè DNA formato da elementi o geni provenienti da individui anche appartenenti a specie diverse es.geni umani inseriti in DNA batterico
Si deve trovare il modo di inserire geni umani in DNA batterico
per ottenere una popolazione di batteri (CLONE) tutti dotati
del gene umano che si desidera rendere funzionale sfruttando
il metabolismo batterico:
es.far produrre ai batteri proteine,ormoni,anticorpi umani
problema:inserire gene umano in un batterio
per indurlo a moltiplicare il gene stesso
allo scopo di averne varie copie disponibili per lo studio
oppure per sintetizzare la molecola codificata:es.insulina
sfruttando la tecnica del DNA ricombinante
elementi necessari per la operazione:
1..DNA con gene della insulina
2..Batteri nei quali inserire il gene da moltiplicare
3..Vettore per trasferire Gene in Batterio:plasmide o fago
4..Enzima di restrizione per segmentare DNA e aprire Plasmide
5..Enzima DNA-ligasi per collegare DNA a plasmide
6..Antibiotici per selezionare batteri ricombinanti da altri
7..Tecniche per riconoscere gene integrato in ogni batterio
8..Colture per moltiplicare batteri ricombinanti con gene insulina
Nota su Plasmide batterico:
molecola breve di DNA chiusa ad anello,che si moltiplica
autonomamemte e si trasmette ai batteri generati
spesso codifica per resistenza a uno o più antibiotici
Nota su Enzimi di restrizione presenti nei batteri
ogni enzima di restrizione riconosce una specifica sequenza
di nucleotidi presenti in ogni tipo di DNA
e separa in due parti il DNA nel punto relativo alla sequenza
In questo modo può frammentare un segmento lungo di DNA
in segmenti più brevi,o aprire anello di plasmide
FASI necessarie per raggiungere il risultato
1..isolare cromosoma con gene da duplicare
2..segmentare DNA usando enzima di restrizione E1
3..isolare plasmidi da colonie batteriche :plasmidi che
..presentano resistenza per AMPICILLINA e TETRACICLINA
4..aprire anello plasmidiale con stesso enzima di restrizione E1
..viene aperto in corrispondenza del gene per TETRACICLINA
5..mescolare frammenti di DNA e plasmidi in presenza di Ligasi
6..inserire i plasmidi in coltura batterica
7..necessario selezionare dalla colonia batteri
..senza plasmidi,con plasmidi puri,plasmidi ricombinanti
8..si tratta la colonia con antibiotico AMPICILLINA
..batteri senza plasmidi:muoiono
..batteri con plasmidi rimangono vivi
9..necessario separare batteri con plasmidi ricombinanti
..da batteri con plasmidi puri
10.si separano singoli batteri e si coltivano separatamente
.in colture numerate,in doppia copia per ogni colonia
.copia1 per controllo e copia2 per riconoscimento
11.si tratta ogni colonia copia2 con TETRACICLINA
12.colonie con plasmidi puri sono resistenti alla TETRACICLINA
.colonie con plasmidi ricombinanti hanno perduto la resistenza
.perchè il GENE si è inserito interrompendo il sito tetraciclina
13.si possono cosi riconoscere le colonie portatrici di plasmidi
.ricombinanti e usare le corrispondenti colonie copia1
14.Problema:con varie tecniche si procede al riconoscimento
.del gene o dei geni integrati nei diversi plasmidi delle
.colonie batteriche ricombinanti
15.operando con il genoma completo di una specie
.si ottiene un insieme di colture batteriche portatrici
.di singoli geni o gruppi di geni:GENOTECA
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