Suo padre, Alessandro, originario di Pavia, era stato assunto come medico condotto a Corteno e Golgi crebbe con l'esempio concreto di quel genitore che vedeva svegliarsi al mattino per partire con la sua borsa verso una qualche remota cascina spersa nelle montagne, dove ci fosse un moribondo da assistere o un bimbo da aiutare a nascere.
Studiò anch'egli medicina, con la "sola aspirazione di conseguire regolarmente il […] diploma professionale", all'Università di Pavia, dove si laureò nel 1865 all'età di 22 anni. Dopo la laurea cominciò la sua attività clinica all'Ospedale S. Matteo in vari reparti di medicina, chirurgia e dermatologia. Divenne però ben presto assistente alla Clinica psichiatrica diretta dall’illustre psichiatra Cesare Lombroso grazie al quale nacque in Golgi l’interesse per lo studio del cervello.
Frattanto, nel tempo libero dagli impegno ospedalieri, Golgi frequentava l'istituto di Patologia Generale, diretto da Giulio Bizzozero, un esponente di punta della nuova medicina sperimentale, da cui acquisì la passione per la ricerca istologica come mezzo per penetrare lo straordinario mistero dell'architettura del sistema nervoso.
Verso il 1872 Golgi aveva acquistato una solida reputazione come clinico e come istopatologo ma tutto ciò non era ancora sufficiente a guadagnargli una posizione soddisfacente all'Università. Così nel 1872, sollecitato dal padre, Golgi partecipò ad un concorso per il posto di primario al Pio Luogo degli Incurabili, un ospedale per malati cronici ad Abbiategrasso, vicino a Milano. Con l’arrivo nell’ospedale di una piccola città, tutto lasciava presagire che la sua attività di ricerca fosse ormai al termine. Tuttavia, dopo alcune iniziali difficoltà, Golgi allestì, nella cucina del suo piccolo alloggio, con pochi strumenti e un microscopio, un rudimentale laboratorio. Il 16 febbraio 1873, scrisse frettolosamente queste parole all’amico Nicolò Manfredi: “lavoro molte ore al microscopio. Sono felice d’aver trovato una nuova reazione per dimostrare anche agli orbico la struttura dello stroma interstiziale della corteccia cerebrale. Faccio agire il nitrato d’argento sui pezzi di cervello induriti in bicromato di potassio. Ho già ottenuto risultati assai belli e spero di ottenere di più”. Questa è la prima testimonianza dell’invenzione della “reazione nera”.
Aiutato dalla sua reazione nera, Golgi, cominciò ad elaborare una teoria generale dell’organizzazione del cervello, la cosiddetta ‘rete nervosa diffusa’. Questa concezione si contrapporrà polemicamente, a partire dagli anni Novanta dell’Ottocento, alla ‘teoria del neurone’, di cui divenne infaticabile paladino lo spagnolo Santiago Ramón y Cajal, i cui studi furono condotti, ironicamente, proprio utilizzando il sistema di colorazione ideato da Golgi. Dopo la scoperta della reazione nera Golgi divenne, nel 1876, professore di Istologia all’Università di Pavia (nello stesso anno, per alcuni mesi, insegnò anche anatomia all’Università di Siena) e dal 1879 in avanti divenne professore di Patologia Genarela ed ottenne la direzione onoraria, con responsabilità cliniche dirette,di un reparto medico all’Ospedale san Matteo.
Tra il 1885 e il 1892 si concentrò sullo studio della malaria umana. Fu ben presto in grado di determinare l’intero ciclo intraeritrocitario di sviluppo del parassita della malaria, il plasmodio (ciclo di Golgi), ma scoprì anche la relazione temporale tra l’accesso febbrile e la segmentazione del parassita (legge di Golgi).
Tra la fine del 1893 e il 1896 fu rettore dell’Università diPavia. Al termine del mandato tornò a dedicarsi agli studi sul sistema nervoso e, utilizzando una variante della reazione nera, fu in grado di osservare, nel 1897, un ‘reticolo’ nelle cellule del citoplasma dei gangli spinali, il cosiddetto ‘apparato reticolare interno’ successivamente chiamato ‘apparato di Golgi’ o ‘complesso di Golgi’.
Nel XX secolo la creatività di Golgi si affievolì, benché continuasse a pubblicare articoli fino al 1923. Il suo tempo si divideva tra le nuove responsabilità alla guida dell’Università di Pavia (fu di nuovo Rettore dal 1901 al 1909) e la carica di Senatore del Regno, alla quale fu eletto nel 1900.
Nel 1906, all’apice della sua fama internazionale, ricevette, insieme al suo eterno rivale scientifico, Ramón y Cajal, il premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina.
In quegli anni condusse una tenace battaglia contro l’istituzione dell’Università di Milano, che considerava una minaccia per Pavia, temendo che potesse fagocitarne prima o poi l’Ateneo. Durante la prima guerra mondiale diresse l’ospedale militare Collegio Borromeo di Pavia e diede impulso al trattamento riabilitativo dei feriti di guerra. Nel 1918, all’età di 75 anni, andò in pensione ma continuò a insegnare come professore emerito fino all’inizio del 1920. Morì a Pavia, il 21 gennaio 1926.