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L'8 novembre, in violazione dell'immunità parlamentare, Gramsci venne arrestato nella sua casa e rinchiuso nel carcere di Regina Coeli. Dopo un periodo di confino a Ustica, dove ritrovò, tra gli altri, Bordiga, il 7 febbraio 1927 fu detenuto nel carcere milanese di San Vittore. Qui ricevette, in agosto, la visita del fratello Mario, le cui scelte politiche erano state opposte a quelle del fratello - già federale di Varese, ora si occupava di commercio - e, soprattutto, quella della cognata Tatiana, la persona che si manterrà sempre, per quanto possibile, in contatto con lui. L'istruttoria andò per le lunghe, perché vi erano difficoltà a montare su di lui accuse credibili: fu anche fatto avvicinare da due agenti provocatori - prima un tale Dante Romani e poi un certo Corrado Melani - ma senza successo.
Il processo a ventidue imputati comunisti, fra i quali Umberto Terracini, Mauro Scoccimarro e Giovanni Roveda, iniziò finalmente a Roma il 28 maggio 1928; per essere meglio servito, Mussolini aveva «fascistizzato» anche la magistratura, istituendo il 1° febbraio 1927 il Tribunale Speciale Fascista. Presidente è un generale, Alessandro Saporiti, giurati sono cinque consoli della milizia fascista, relatore l'avvocato Giacomo Buccafurri e accusatore l'avvocato Michele Isgrò, tutti in uniforme; intorno all'aula, «un doppio cordone di militi in elemetto nero, il pugnale sul fianco ed i moschetti con la baionetta in canna». Gramsci è accusato di attività cospirativa, istigazione alla guerra civile, apologia di reato e incitamento all'odio di classe.
Il pubblico ministero Isgrò concluse la sua requisitoria con una frase rimasta famosa: «Per vent'anni dobbiamo impedire a questo cervello di funzionare»; e infatti Gramsci, il 4 giugno, venne condannato a venti anni, quattro mesi e cinque giorni di reclusione; il 19 luglio raggiunse il carcere di Turi, in provincia di Bari.