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Christine Johnson

 

IL VERO SIGNIFICATO

DEL TEST DELL’AIDS

 Quanto è attendibile un HIV-test positivo?

 

 

Nota dell’editore (Andromeda)

 

 

L’argomento del presente lavoro è lo studio effettuato dai dott. Eleni Papadopulos-Eleopulos, Valendar F. Turner e John M.Papadimitriou intitolato “Is a positive Western Blot proof of HIV infection?” - apparso su Biotechnology nel giugno 1993 - che pubblichiamo integralmente in lingua originale in Appendice.

 

Sono sorte delle controversie sulle possibili interpretazioni di questo studio. Noi pubblichiamo quella di Christine Johnson (ricercatrice e membro del Mensa) la quale ha passato molte ore comunicando via posta elettronica col Dr.Turner (uno degli autori del lavoro), proprio per assicurarsi della correttezza della propria interpretazione.

 

  

La versione originale di questo lavoro di Christine Johnson è stata pubblicata sul n. 1 del maggio 1994 del “Journal of International Health Research”, col titolo “Understanding the HIV antibody test”. La suddetta rivista è pubblicata dal “People International Health Project”, 8033 Sunset Boulevard # 2640, Los Angeles, California - USA.  

Riprodotto per gentile concessione dell’editore americano .

 


 

“E’ stata l’esperienza più terrificante della mia vita. Andai completamente fuori di testa.”

 “Quando lo seppe, salì sul tetto dell’ospedale e si buttò giù.”

 “Su di me, l’impatto emozionale fu immenso. Non riuscivo a controllare la paura.”

 Queste persone stanno forse parlando di una diagnosi di AIDS? No, queste sono le reazioni di persone sane senza sintomi il cui HIV-test è risultato positivo. Gli effetti di un test positivo sono così devastanti che nessuno dovrebbe sopportare questo imponente “fardello” se non si è assolutamente sicuri che il test sia una misurazione reale e significativa della presenza dell’HIV nell’organismo. Questa affermazione introduce ed indica lo scopo di una pubblicazione che possiamo definire rivoluzionaria: “Is a positive Western Blot proof of HIV infection?” (Un Western Blot positivo è una prova dell’infezione da HIV?), pubblicato sulla rivista BIOTECHNOLOGY JOURNAL nel giugno 1993.

Gli autori, gli australiani Dott. Eleni Papadopulos-Eleopulos, Turner e Papadimitriou, dimostrano che benché ci sia stato detto che possiamo fidarci dell’accuratezza di questi “test dell’AIDS”, in realtà è meglio non fidarsi. Essi discutono i test e come questi vennero accettati come prova virtualmente incontestata che una persona sia stata infettata dall’HIV. Essi inoltre criticano questi test su diverse basi: i test non sono specifici, non c’è un modo standard di interpretarli, ed i risultati non sono riproducibili. Perché un test anticorpale sia scientificamente valido, esso deve soddisfare questi tre criteri.

Tanto per cominciare, cosa significa “specificità”? La specificità è il numero di risultati negativi che il test ottiene in persone che sicuramente non hanno la malattia in questione. Un test che abbia una specificità del 100% risulta sempre negativo quando la malattia è assente. Non ci sono “falsi positivi”. Come si determina se la malattia (in questo caso l’infezione da HIV) è presente o no?

I test per gli anticorpi anti-HIV sono basati sull’idea che se sono presenti gli anticorpi relativi ad un virus, una proteina del virus, e quindi il virus stesso, sono per forza presenti. Così per vedere se il test sta facendo esattamente il suo lavoro, è necessario avere un metodo indipendente per poter verificare la presenza di un virus in una persona sieropositiva (cioè che presenta gli anticorpi per quel virus) e l’assenza del virus in una persona sieronegativa (che non presenta cioè gli anticorpi). Questo metodo indipendente è chiamato “gold standard” o “standard aureo”.

L’unico standard aureo adeguato sarebbe l’isolamento del virus stesso. Poiché i virus hanno bisogno delle cellule viventi dell’ospite per potersi riprodurre, essi vengono coltivati in colture di cellule. L’isolamento dell’HIV presuppone che il virus sia estratto da una coltura e sia separato da qualsiasi altra cosa presente nella coltura stessa, in modo che rimanga solo il virus puro.

Diciamo che 100 persone siano risultate prive del virus mediante l’isolamento virale. Tutte queste persone vengono sottoposte ad un test per l’HIV e di questi 90 risultano negativi e 10 positivi (falsi positivi). Questo dà al test una specificità del 90% (che non è un granché). Se il test fosse specifico al 100%, esso non risulterebbe mai positivo in una persona (sia che abbia sintomi o meno) che non è stata infettata dall’HIV, come determinato dall’isolamento del virus.

Benché vengano fatte molte affermazioni che il test per gli anticorpi anti-HIV sia assai specifico, Eleopulos e colleghi sostengono che non sia così. Un test che non sia specifico, risulterà positivo anche in presenza di anticorpi diversi da quelli che dovrebbe rivelare. Chiaramente, se un test per l’HIV non è specifico, un risultato positivo è per lo meno ambiguo.

Ricordiamo per un momento la definizione di anticorpo e quella di antigene, poiché ne parleremo lungo tutto questo lavoro. Gli anticorpi sono i “fanti” del nostro corpo nella guerra contro invasori esterni quali batteri e virus. Il sistema immunitario produrrà un tipo di anticorpi che avrà una attrazione biochimica unica e specifica per le proteine di quel particolare virus “invasore”. Quando gli anticorpi “vedono passare” una particella virale, essi la attaccano rendendola inoffensiva. Se c’è bisogno, il sistema immunitario produrrà molte migliaia di anticorpi differenti, ognuno dei quali attaccherà uno specifico antigene.

Gli antigeni sono sostanze estranee all’organismo che potrebbero farci ammalare o perfino ucciderci se il nostro sistema immunitario non le neutralizzasse con gli anticorpi. Gli antigeni includono virus, batteri, tossine, o tessuti di altre persone (come lo sperma che potrebbe entrare in circolo durante un rapporto anale). Gli anticorpi si combinano coi loro antigeni come una chiave nella serratura e questa azione risulta in una neutralizzazione dell’antigene cosicché questo non possa più nuocerci.

Questi principi vengono usati nei test per la ricerca degli anticorpi anti-HIV, che funzionano più o meno in questo modo: nel test ELISA, una mistura di proteine, che si ritiene provenga solo dall’HIV, viene messa a contatto con un campione di sangue in modo che ogni anticorpo eventualmente presente nel sangue che sia in grado di legarsi con queste proteine, abbia la possibilità di farlo. Se tutte le proteine della mistura provengono realmente dall’HIV, e se tutti gli anticorpi riconoscono soltanto le proteine dell’HIV, un risultato positivo in questo test significherà che, in un qualche momento nel passato, la persona è stata esposta al virus. Ma, come la Eleopulos ed i suoi colleghi dimostrano nel loro articolo rigorosamente argomentato ed ampiamente referenziato, queste due condizioni essenziali non vengono soddisfatte in nessuno dei due test anticorpali (ELISA o Western Blot) attualmente in uso!

Quindi abbiamo già due grossi problemi: 1) non tutte le proteine della mistura derivano sicuramente dall’HIV; 2) non tutti gli “anticorpi-HIV” riconoscono sicuramente solo l’HIV. In realtà Eleopulos e colleghi sottolineano che in realtà non c’è alcuna prova che addirittura nessuna delle supposte proteine dell’HIV provenga proprio dall’HIV!

La ragione è che l’isolamento del virus ha presentato numerose difficoltà insormontabili (che discuteremo più avanti). La posizione degli autori è che l’HIV non è mai stato isolato e quindi nessuno può essere sicuro che le proteine in questione derivino effettivamente dall’HIV. Ne deriva che se non possiamo essere sicuri che le proteine del test derivino dall’HIV, non possiamo neppure essere sicuri che gli anticorpi che reagiscono con queste proteine siano anticorpi anti-HIV. Ci sono molti casi documentati di reattività-crociata degli anticorpi, nei quali anticorpi di altre malattie o condizioni causano un risultato falso-positivo. L’unico modo per saperlo con certezza è applicare uno standard aureo.

Nel test Western Blot (WB), le presunte proteine dell’HIV vengono presentate separatamente anziché in una mistura e, dopo essere state messe a reagire con un campione di sangue, ogni proteina è in grado di dare un segnale visibile del fatto che ha legato un anticorpo. (v. Fig. 1 per una illustrazione di come appare un risultato di WB) 

FIGURA 1

            Rappresentazione schematica di risultati del WB:

            (A) Risultato positivo (reazione a tutti gli antigeni)      

            (B) Risultato negativo. 

Così, mentre l’ELISA può solo determinare che un campione di sangue contiene alcuni anticorpi che sembrano essere stati provocati dall’HIV, un Western Blot, almeno in teoria, può determinare a quali particolari proteine del virus si sono legati gli anticorpi.

Poiché il test ELISA è noto per essere tutt’altro che perfettamente specifico, il Western Blot, che è ritenuto altamente specifico, viene generalmente usato per “confermare” la diagnosi.

Infatti è dato un così grande valore al Western Blot che un suo risultato positivo è quasi sempre preso come equivalente di una infezione attiva da HIV. Ma in realtà, quanto è effettivamente accurato questo test “definitivo”?

La Figura 2 inizia con una tabella che mostra quali proteine devono essere presenti perché un Western Blot sia giudicato positivo, secondo cinque differenti autorità. Voi potreste mescolarle e pescare a caso. Prendetene almeno uno da ogni categoria richiesta ed il vostro test sarà interpretato come positivo.

La figura 2 mostra anche come viene letto il test Western Blot. Ogni proteina dell’HIV che ha “trovato” un anticorpo si rende visibile sulla striscia nella sua specifica area, chiamata banda. Ci sono parecchie bande che si suppone rappresentino specifiche proteine virali. Le più importanti di queste sono gp120/160, p41, p31-32, e p24. In realtà, queste proteine potrebbero non rappresentare affatto le proteine dell’HIV!

Diamo un’occhiata ad ognuna di queste proteine principali, e vediamo se la loro presenza in una striscia di Western Blot sia effettivamente indicativa della presenza dell’HIV:  

p41: Già all’inizio, il Dr.Montagnier, lo scopritore dell’HIV, trovò che il sangue dei pazienti affetti da AIDS reagiva con una proteina p41 che era stata trovata sia nelle cellule infettate dall’HIV che in quelle non infettate. Si concluse che la banda p41 era il risultato della contaminazione del virus da parte di una proteina chiamata actina, che è una normale componente di tutte le cellule, come pure di altri microbi oltre all’HIV. In altre parole, molte altre cose, oltre all’HIV, possono provocare una reazione positiva della banda p41.

 gp120 e gp160: il gp120 viene riscontrato sulle “spine” presenti sulla superficie delle particelle immature dell’HIV, ed il gp160 si ritrova solo nelle cellule infette, ma nessuno dei due è presente nelle particelle virali libere e mature. Comunque il sangue dei pazienti affetti da AIDS reagisce con “l’HIV purificato” del test dell’AIDS, ed appaiono le bande gp120 e gp160. Questa è una contraddizione. Poiché nel virus maturo non si trovano né gp120 e né gp160, non ce ne dovrebbero essere neppure nell’antigene preparato per il test. Quindi, da dove vengono queste due bande?

Se il gp160 viene a sua volta separato, otterremo gp120 e p41. Si pensa, allora, che le bande gp120 e gp160 in realtà non rappresentino le proteine gp120 e gp160, ma piuttosto rappresentano ciò che i chimici definiscono oligomeri del p41. Un oligomero è un numero intero di subunità di qualcos’altro. Se mettete insieme quattro unità di p41, ottenete un gp160; tre di queste subunità danno un gp120 (4x40=160; 3x40=120). Quindi il gp120 e il gp160 non sono affatto proteine diverse; esse sono semplicemente delle differenti “confezioni” di p41, tenute insieme da ponti chimici. E se, come abbiamo discusso più sopra, il p41 è semplicemente un contaminante di materiale cellulare, questo annulla a sua volta anche l’importanza del gp120 e del gp160.

p31-32: Le proteine sono composte da aminoacidi. Nel 1987 L.E.Henderson (1) effettuò uno studio in cui confrontava le sequenze aminoacidiche dell’ HIV “purificato” con quelle di una normale proteina trovata nel sistema immunitario umano e chiamata “Class II histocompatibility DR protein” e scoprì che le proteine DR sono identiche alle proteine p31-32 dell’HIV. Bye-bye p31-32!

p24: Il riscontro della p24 è considerato sinonimo della effettiva presenza dell’HIV. Comunque il Dr.Robert Gallo (co-scopritore dell’HIV), ha ripetutamente affermato che la p24 non è esclusiva dell’HIV, ma che un altro retrovirus (HTLV-1, che non causa malattie) contiene p24, e questo crea una reazione crociata al test per gli anticorpi. Il test può dire che avete anticorpi contro l’HIV, mentre in realtà potrebbe essere l’HTLV-1.

In realtà, la p24 è stata trovata nell’HTLV-1, HTLV-2, HIV-2, ed in tutti i retrovirus endogeni. Il gene specifico che contiene l’informazione per produrre p24 (chiamato gene gag) si trova in tutti i retrovirus. Non sorprende quindi che la p24 sia riscontrata spesso in assenza di HIV.

Se una banda p24 appare da sola in un WB Test, il test verrà definito “indeterminato”. Questo significa che il test non mostra abbastanza bande per essere sicuri di qualcosa, ma generalmente un test indeterminato non è motivo di allarme. La p24 è la banda predominante nel causare un WB Test indeterminato. Il risultato indeterminato è molto comune e non è correlato con la presenza dell’HIV. Viene fatto riferimento ad un gruppo di pazienti che ricevettero sangue testato col Western Blot e risultato negativo; entro sei mesi, il 42% di questi pazienti sviluppò un test indeterminato.

La Eleopulos ed i suoi colleghi forniscono una lista di condizioni in cui i pazienti hanno anticorpi p24 senza HIV: Sclerosi multipla, verruche generalizzate, linfoma cutaneo a cellule T, e persino una persona sana su 150. Negli studi citati, l’antigene p24 fu trovato solo nel 25-50% dei pazienti HIV+ o affetti da AIDS. Se ne concluse che il test dell’antigene p24 è “impreciso” e “dovrebbe essere interpretato con cautela”. Sembra quindi che non ci possiamo più fidare neppure del p24.

A dispetto di tutte le prove contrarie, le bande gp120, gp160 e p41 vengono considerate come rappresentative di distinte proteine virali.

In conclusione la Eleopulos sostiene che “alla luce di quanto esposto, è difficile sostenere la tesi che le bande p41 (e quindi gp120 e gp160), p32 o p24 rappresentino specifiche proteine dell’HIV.” Inoltre, ella pensa che anche se queste proteine si dimostrassero specifiche dell’HIV, noi non potremmo comunque dedurne che gli anticorpi che reagiscono con esse siano diagnostici di una infezione da HIV (discuteremo più oltre le reazioni crociate).

Come potete vedere dalla tabella nella Figura 2, le differenti agenzie considerano positivo un WB Test quando almeno due o tre bande sono presenti, e voi potete sceglierle fra le proteine dell’HIV appena presentate. Comunque, poiché la banda p31-32 rappresenta una proteina cellulare, e le gp120 e gp160 sono solo differenti forme della p41, tutto ciò che vi resta fra cui scegliere sono la p24 e la p41, che però potrebbero anche non  rappresentare affatto una proteine dell’HIV.

Riassumendo, il Western Blot è basato sull’individuazione di cinque principali bande di proteine: p24, p32, p41, gp120 e gp160. Sono stati forniti dati che consentono di dubitare dell’autenticità di ognuna di queste proteine come sempre rappresentativa delle proteine dell’HIV.

E come se questo non fosse già abbastanza, l’articolo australiano esprime la preoccupazione che non ci sia un modo standard di interpretare il Western Blot. Ci sono varie configurazioni di bande. Cosa significano? Poiché un test anticorpale significhi qualcosa, esso deve essere standardizzato. Come afferma la Eleopulos: “il risultato del test deve avere lo stesso significato in tutti i pazienti, in tutti i laboratori ed in tutti i paesi.” In realtà, il campione di sangue di un paziente affetto da AIDS:

* può non reagire con tutte le proteine dell’HIV

* può reagire con proteine non appartenenti all’HIV

* può dare risultati differenti su differenti campioni di sangue ottenuti dallo stesso paziente in momenti diversi

Per questo le varie agenzie hanno stabilito i criteri indicati sulla Figura 2. A seconda di quali di questi criteri voi usate, lo stesso gruppo di pazienti affetti da AIDS otterrà un tasso di positività che varia dal 50% al 79%. La Eleopulos sostiene che “nella letteratura scientifica non sono mai state pubblicate strisce di uno standard di positività del Western Blot.” Inoltre, la serie di bande ottenute potrà variare con la temperatura e con la concentrazione dei reagenti chimici usati nel test.

Come Zolla-Pazner et al. riconoscono, c’è “confusione sull’identificazione di queste bande” che è “risultata in conclusioni non corrette...”(2). Voi potete sempre sperare che non sia il vostro test che ha dato una di queste “conclusioni non corrette”!

Infine, un test deve essere riproducibile per poter essere valido. Usando un singolo campione di sangue, le bande dovrebbero essere le stesse (o assai simili) su test ripetuti diverse volte, o su test effettuati da laboratori differenti. Il CRSS fece uno studio nel quale due campioni positivi e due campioni negativi vennero inviati a 19 laboratori perché effettuassero un WB Test. Lo stesso siero fu testato diverse volte in ogni laboratorio, e le bande che ne risultarono mostrarono variazioni quasi estreme sia da un laboratorio all’altro, che da un test all’altro nello stesso laboratorio.

Va notato che i laboratori considerati erano “Reference Labs” (Laboratori di Riferimento), cioè quelli che vengono definiti laboratori di prima qualità.

La Eleopulos fa notare che questi laboratori “top” costituiscono solo una piccola parte  dell’insieme dei laboratori che effettuano questo test, e poiché la maggior parte degli altri laboratori non è altrettanto qualificata, presumibilmente ci saranno un maggior numero di errori, e quindi di falsi positivi.

Il fenomeno dei falsi positivi è il più grosso problema di questi test basati sugli anticorpi. Un gran numero di test effettuati in Russia col metodo Elisa diede 280 falsi positivi per ogni vero positivo (un rapporto quindi di 280 a 1!). Nonostante le molte prove del contrario, c’è un “consenso generale che la specificità dei test anticorpali per l’HIV sia stata definitivamente provata” (3).

La credenza che i test anticorpali siano specifici al 98%-100% è basata sui lavori di Gallo, Burke e dei loro colleghi. Come standard aureo, Gallo usò la sindrome clinica. Ma tutte le malattie indicatrici di AIDS esistono da secoli, quindi la loro presenza non è una prova che l’HIV sia presente nell’organismo. Inoltre, Gallo andava dicendo che finché un paziente aveva dei sintomi che somigliavano all’AIDS, un test positivo doveva essere corretto. Il fatto che una persona abbia la sindrome chiamata AIDS non ha nessuna influenza sull’accuratezza del test per gli anticorpi anti-HIV.

Burke testò un gruppo a basso rischio di reclute e trovò 15 positivi su un totale di 135.187 persone. Ricontrollando ognuno di questi positivi con altri quattro differenti test anticorpali, trovò che 14 erano ancora positivi, mentre 1 era negativo su tutti e quattro i test. Egli calcolò allora che i falsi positivi fossero 1 su 135.187, cioè lo 0,0007%.

Il gruppo della Eleopulos critica la metodologia di Burke per determinare il tasso di falsi positivi. Per definizione, un vero positivo è un test risultato positivo in una persona che è infettata dall’HIV, come verificato da un test indipendente (lo standard aureo); un falso positivo è un test risultato positivo in una persona in cui l’applicazione dello standard aureo ha escluso la presenza dell’HIV. I quattro test anticorpali che Burke utilizzò per confermare i risultati del suo WB non forniscono una prova indipendente della presenza o dell’assenza dell’infezione da HIV. Questi quattro test, come l’originale WB, cercano tutti gli stessi anticorpi, cioè sono essenzialmente lo stesso test. Un test non può fungere da standard aureo per sé stesso.

Quindi, poiché Burke non utilizzò uno standard aureo, era impossibile per lui misurare il tasso di falsi positivi per il suo WB Test.

Gli autori non stimano la reale incidenza dei falsi positivi, ma altri l’hanno considerata attorno al 90%, e potrebbe essere ancora più alta (11).

Un altro problema sembra essere il fatto che se voi ripetete varie volte il test a persone risultate inizialmente positive, un buon numero di queste finirà per risultare negativo. Se effettuate due Elisa e poi due WB in successione, molte di queste persone risulteranno negative ad ogni test successivo, cosicché quando arriverete al quarto test, solo pochi saranno ancora positivi. Se a questo gruppo di persone fossero stati effettuati solo uno o due test, essi sarebbero considerati infettati dall’HIV, mentre in realtà la maggior parte di loro non lo è.

Questo è un grosso difetto dei test anticorpali. Il test ufficiale di screening è l’Elisa, che ha un tasso di falsi positivi astronomico, e la definizione corrente di AIDS del CDC accetta un singolo Elisa positivo senza conferma. In altre parole, un singolo Elisa positivo (più una malattia indicatrice di AIDS) vi fa meritare una diagnosi ufficiale di AIDS.

In pratica un Elisa positivo può o meno essere confermato da un Western Blot e in ogni caso, come abbiamo appena visto, un singolo test, o anche parecchi test in successione, possono essere tutti falsi positivi, e una persona può avere un risultato negativo al terzo, quarto, quinto test, e così via. Quindi un semplice test di screening o anche un test di screening più un test di conferma (Elisa + WB), spesso possono dare un quadro non esatto della reale situazione.

Né Burke et al. (4) né Gallo et al. (5) testarono persone che avevano “altre malattie dove gli anticorpi, alcuni dei quali possono interagire con gli antigeni dell’HIV, possono essere prodotti per altre ragioni.”

La Eleopulos discute il fenomeno dei “falsi positivi biologici” (BFPs), falsi positivi, cioè, che risultano in pazienti affetti da varie patologie non collegate alla condizione per cui vengono testati. Questo è un fenomeno piuttosto comune, ad esempio, nei test per la sifilide.

Io stessa ho avuto un falso positivo in un test per la sifilide dovuto ad una precedente malattia da graffio di gatto. Falsi positivi alla sifilide possono  verificarsi in pazienti con lupus, anemia emolitica autoimmune, porpora trombocitopenica idiopatica, lebbra o nei tossicodipendenti.

Alcuni gruppi di persone producono una grande quantità di anticorpi perché sono esposti ad un numero maggiore di malattie e condizioni malsane rispetto alla norma. Questi gruppi includono Africani poveri e tossicodipendenti. Secondo Biggar et al. “la reattività dell’ELISA che del WB può non essere specifica negli Africani...”(6). E, naturalmente, tutte le nostre idee sulla presunta gigantesca epidemia di AIDS in Africa sono basate sui programmi di test Elisa.

La letteratura scientifica è piena di riferimenti a dati che mostrano la “presenza diffusa di interazioni non specifiche fra agenti retrovirali ed anticorpi non correlati”. La Eleopulos cita un lungo elenco di reazioni crociate. Un soggetto ricevette ripetutamente sangue HIV negativo ed il suo WB test, che era inizialmente negativo, ad ogni iniezione divenne sempre più intensamente positivo. Topi a cui furono iniettati linfociti T non infetti provenienti da un altro ceppo di topi svilupparono anticorpi anti-HIV! Il test dà inoltre una reazione crociata nei pazienti affetti da malaria: il 25-40% dei pazienti Venezuelani affetti da malaria erano WB positivi, ma non avevano l’AIDS.

La Eleopulos e colleghi credono che tutte queste difficoltà con la specificità del WB potrebbero essere evitate con l’uso dell’isolamento dell’HIV come standard aureo, che è l’unico metodo accettabile; comunque “questo non è stato ancora fatto, e potrebbe non essere neppure fattibile”.

Isolare l’HIV significa separare la pura particella virale da tutto l’altro materiale presente nella coltura cellulare. Per usare l’isolamento del virus come standard aureo, dobbiamo essere assolutamente certi che il materiale che abbiamo isolato sia realmente il virus che stiamo cercando e nient’altro - non un altro virus, non frammenti di cellule, non particelle “simil-virali”, e così via. Il metodo usato per isolare il virus comprende il separare la parte liquida della coltura cellulare (il surnatante) e metterlo in una centrifuga. Questo separa le particelle a seconda della loro differente densità. E’ un po’ come dire la differenza fra due palle apparentemente identiche, una fatta d’acciaio e l’altra di plastica, gettandole in una piscina - la palla d’acciaio affonda, mentre quella di plastica galleggia. La figura 3 illustra questo principio.

FIGURA 3

(a)  distribuito omogeneamente in tutto il tubo prima della centrifugazione;

(b) durante la centrifugazione si stabilisce un gradiente, e le particelle campione vengono distribuite in strati diversi a seconda della loro densità.

Si ritiene che il materiale che si deposita ad una densità di 1,16 gm/ml sia composto soltanto da particelle virali. Il problema qui è che alcune parti delle cellule hanno la stessa densità dei virus. Alcuni eminenti virologi hanno sottolineato che non si può evitare la contaminazione della preparazione virale con vari tipi di materiale cellulare e frammenti di cellule, poiché la cellula si rompe durante il procedimento. Poiché una parte del materiale cellulare ha la stessa densità del virus, se avete una banda a 1,16 gm/ml, non potete essere ancora sicuri di cosa sia. A causa di questo problema, i ricercatori che negli anni ‘70 cercavano di isolare dei retrovirus puri, confermavano visivamente i loro ritrovamenti per mezzo del microscopio elettronico.

Usando le tecniche suddette, i migliori risultati potrebbero essere ottenuti con un surnatante fluido che contenga molti virus e molto pochi contaminanti cellulari. Queste condizioni possono essere soddisfatte al meglio da virus che non uccidono le cellule che infettano ed in condizioni di coltura in cui la maggior parte delle cellule resta viva (ed intatta) durante l’infezione. I retrovirus soddisfano queste condizioni. Queste proprietà dei retrovirus rendono molto più facile il separarli da qualsiasi altra cosa, inclusi i contaminanti cellulari. Questo vale per la maggior parte delle colture retrovirali. Comunque, con l’HIV, capita l’opposto.

Le colture di tessuti affetti da AIDS presentano assai pochi virus, così pochi che è difficile addirittura trovarli. E’ difficile tenere vive le cellule in queste colture. Gallo, Montagnier e gli altri ricercatori hanno sempre trovato una concentrazione molto bassa di queste particelle simil-virali nelle loro colture di tessuti. Così qui avete molte cellule e poche particelle simil-virali che essi hanno chiamato particelle virali (notate che il fatto che queste particelle assomiglino ad un virus non costituisce una prova che esse siano realmente dei virus). Questa situazione vi darà i peggiori risultati nel tentativo di separare le particelle virali pure da qualsiasi altra cosa che si depositi a 1,16 gm/ml.

Inoltre, l’opinione ufficiale sull’HIV è che esso, a differenza degli altri retrovirus, uccida le cellule. Ci sono molte teorie su come lo faccia, inclusa la “apoptosi”, una sorta di suicidio cellulare.

Se l’HIV, in un modo o nell’altro, è responsabile della morte della cellula, il risultato sarà che le cellule morte si saranno rotte, ed il surnatante fluido sarà pieno di frammenti cellulari e di materiale cellulare derivante da queste cellule rotte.

Poiché una parte di questo materiale cellulare ha la stessa densità dei retrovirus, è assai difficile sapere cosa in realtà sia contenuto nella banda che si suppone rappresenti il “puro HIV”.

La Eleopulos e colleghi sostengono che nessuno sappia quali particelle, ammesso che ce ne siano, si depositano a 1,16 gm/ml e nessuno conosce la densità di quello che viene chiamato HIV. Essi sostengono che “la maggior parte, se non tutti, i pretesi ‘isolamenti dell’HIV’ sono derivati da lisati cellulari”. (3) (Un lisato è il materiale formato dalla frammentazione delle cellule). Infatti, “le prove disponibili... indicano che solo circa il 20% delle proteine che si depositano a 1,16 gm/ml sono proteine dell’HIV, le rimanenti sono proteine cellulari ”(3).

Questa situazione molto probabilmente deriva dal fatto che le colture “infettate dall’HIV” muoiono e che le colture in generale vengono molto spesso deliberatamente lisate.

Per uscire da questa confusione, sarebbe utile dare un’occhiata a questo materiale col microscopio elettronico ma, come la Eleopulos e colleghi ci fanno notare, la letteratura sull’AIDS non contiene neppure una fotografia al microscopio elettronico del materiale che si deposita a 1,16 gm/ml, e non c’è nessun modo che ci consenta di sapere se questo materiale “contenga qualcuna di queste particelle (HIV puro)”. Essi sottolineano che in letteratura sono usati termini quali “HIV”, “isolamento dell’HIV”, “particelle pure”, “particelle virali”, e così via, e questi termini hanno una varietà di significati, ma quasi sempre “senza alcuna prova della presenza di una particella virale.”

Ci sono molte “prove” accettate dell’isolamento dell’HIV che in realtà non sono affatto prove. Per esempio, c’è una sostanza chiamata “template primer AndT15” che viene copiata se è incubata col surnatante o col materiale che si deposita a 1,16 gm/ml. Questo fatto viene considerata prova della attività trascriptasi inversa e quindi dell’isolamento dell’HIV. Comunque, la stessa sostanza viene copiata se incubata con parecchi altri tipi di cellule che non sono infettate dall’HIV, inclusi gli spermatozoi normali e non infetti. Essa viene sì copiata dalla trascriptasi inversa (che si trova nei retrovirus), ma viene anche copiata dalla DNA-polimerasi cellulare (che non si trova nei retrovirus).

Certe particelle sono riscontrate nelle colture dell’AIDS e sono considerate, da molti ricercatori, l’HIV stesso. Comunque, ci sono un sacco di situazioni dove le particelle HIV vengono trovate insieme a particelle non-HIV, o insieme a particelle “similvirali”, che sono comunque “un po’ differenti” da quelle che comunemente vengono considerate particelle di HIV, e così via. L’HIV è un retrovirus di tipo C e particelle di tipo C appaiono in cellule di linfoma non infette che sono metabolicamente in difficoltà. “Particelle retrovirali” che hanno proprietà antigeniche simili all’HIV sono state riscontrate in pazienti con sindrome di Sjogren. Particelle virali indistinguibili dall’HIV sono riscontrate in un gran numero di linfoadenopatie non associate all’HIV.

Da qui la conclusione che “la presenza di tali particelle (da sola, non) indica infezione da HIV (7). Sembra essere quasi impossibile isolare l’HIV e sapere per certo che avete esattamente in mano l’HIV e non un’altra delle entità succitate. Ed anche se i ricercatori hanno accettato un’ampia varietà di fenomeni come rappresentativi dell’isolamento dell’HIV, ed hanno compiuto sforzi immani per isolarlo, “non è ancora possibile isolare l’HIV da tutti i pazienti sieropositivi.”(3).

D’altra parte, l’HIV può essere “isolato” da pazienti che non hanno l’AIDS e che sono sieronegativi! Usando la ricerca del p24 come metodo di isolamento dell’HIV, sono stati ottenuti risultati positivi nella grande maggioranza di un gruppo persone “presumibilmente non infette” con test anticorpali indeterminati, ed in tutti i soggetti di un gruppo di donatori di sangue sieronegativi.

Non c’è assolutamente nessuna correlazione fra “l’isolamento dell’HIV” ed un test anticorpale positivo, ed il CDC lo ammette. Il CDC definisce “infezione documentata” un test anticorpale positivo, però dice anche che “il virus non può essere ritrovato in ogni persona con una infezione documentata” (8).

Quindi usare l’isolamento dell’HIV come standard aureo per autenticare la validità dei test anticorpali è per lo meno problematico.

Un altra possibilità di rintracciare il virus ci è data dalle ricerche genomiche. Lo scopo è quello di riuscire a provare che il paziente affetto da AIDS è stato infettato da un unico retrovirus esogeno. (Esogeno significa che ha origine al di fuori dal corpo, al contrario di endogeno che significa originato dall’interno del corpo). Un genoma è semplicemente l’insieme delle informazioni ereditarie che si trovano nei geni, che sono fatti di DNA e di RNA. Sembra che una volta determinato che un certo retrovirus ha una particolare sequenza genetica, se riuscite a ritrovare questa sequenza genetica possiate affermare di aver trovato il virus. Bene, in realtà non è così semplice.

L’informazione sul genoma è contenuta nel DNA o nell’RNA. Un retrovirus non possiede DNA, ma solo RNA. Il retrovirus infetta una cellula per mezzo della trascriptasi inversa che trasforma il suo RNA in DNA, questo DNA viene poi immesso nella cellula, dove diventa parte integrante del DNA cellulare. Questa “traduzione in DNA” delle informazioni genetiche del retrovirus, può poi essere utilizzata come modello, o schema, per produrre altre copie del virus stesso, che poi vengono espulse dalla cellula. Il genoma retrovirale, quando è integrato nel DNA della cellula, viene chiamato provirus.

Ci sono vari fenomeni che rendono assai difficoltosa ogni analisi genomica dei retrovirus, ma i principali sono i seguenti:

Non ci sono due genomi HIV uguali.

“Non sono mai stati isolati due HIV identici, neppure nella stessa persona” (1,3) in differenti momenti o nello stesso momento. Nello stesso paziente, gli HIV provenienti da diversi tipi di cellule sono differenti. Differenti tipi di cellule utilizzate nelle colture cellulari, producono HIV differenti.

La sequenza dell’HIV non può essere riscontrata in tutti i pazienti affetti da AIDS.

Per quanto si applichino, i ricercatori non trovano mai molti virus nei pazienti affetti da AIDS, ed in molti casi non ne trovano addirittura nessuno! Il test PCR (polymerase chain reaction) fu introdotto per agevolare il ritrovamento dei virus. Si dice che consenta l’equivalente di trovare un ago in un pagliaio, poiché essa può trovare un gene, o un frammento di gene, ed amplificarlo fino al punto in cui sia possibile individuarlo. Questo è il test che vedete in tutti gli annunci pubblicitari e che promette risultati accurati già entro le prime quattro settimane dall’infezione.

Anche con questo test, “c’è rarità o apparente assenza di DNA virale in una percentuale di pazienti”(10). La PCR non è in grado di trovare  l’HIV nella maggioranza dei campioni di sperma di pazienti affetti da AIDS. Cosa significa questo per la teoria che l’AIDS è una malattia sessualmente trasmessa? Se la PCR non può trovarlo, significa semplicemente che non c’è nulla da trovare.

Comunque, la Eleopulos e colleghi commentano che anche con la PCR, c’è una qualche confusione sul significato dei risultati del test, specialmente quando si tenta di usarla come standard aureo per confermare la reale presenza del virus nell’organismo dei soggetti sieropositivi.

Furono testati dei campioni di sangue usando la PCR ed il test standard Elisa, ed i risultati vennero confrontati. Da un laboratorio all’altro, la corrispondenza fra i due variava dal 40 al 100%, il ché significa che fra lo 0 ed il 60% dei casi, uno o l’altro di questi test ha dato risultati sbagliati. Sono stati osservati falsi positivi e falsi negativi anche con la PCR.

Un risultato di ibridizzazione positivo può non essere specifico per l’HIV.                        

L’ibridizzazione è una tecnica di laboratorio utile nell’identificare cellule in cui si replica l’HIV. Nei primi studi di Gallo sull’ibridizzazione, egli trovò che le bande erano “deboli” o di “segnale basso”. Egli pensò che questo significasse che non c’erano molti virus ma concesse che il test potesse reagire ad un virus omologo (cioè differente ma molto simile come struttura ed origine). Questa pubblicazione sostiene che sia vera la seconda ipotesi. Sequenze collegate all’HIV sono state riscontrate anche in cellule normali, cosicché molti fenomeni attribuiti all’HIV potrebbero essere di origine cellulare.

La Eleopulos ed i suoi colleghi concludono dicendo, in maniera molto diplomatica, che l’uso dei test anticorpali per diagnosticare l’infezione da HIV, o per effettuare indagini epidemiologiche, “deve essere attentamente riconsiderato”.

Io sarò meno diplomatica e vi dirò che questi test non sono affatto accurati; che sono un pericoloso inganno e che è assai rischioso prendere decisioni di vita o di morte basandosi su di un test risultato positivo. Il farlo può portare solo alla tragedia.

Riferimenti bibliografici 

1).            Henderson, L.E., Sowder, R., Copeland, T.D., et.al. 1987. Direct identification of Class II hysto–compatiblity DR proteins in preparations of Human T–cell lymphotrophic virus type III. J.Virol. 61:629-632.

2).        Zolla–Pazner, S., Gorny, M.K., Honnen, W.J., 1989. Reinterpretation of human immunodefinciency virus Wetsern Blot patterns. New England Journal of Medicine. 320:1280-1281.

3).            Papadopulos–Eleopulos, E., Turner, V.F., Papadimitriou, J.M. 1993. Is a positive Western Blot proof of HIV infection? Bio/Tecnology. 11:696-707.

4).        Burke, D.S., Brundage, J.F., Redfield, R.R., et.al. 1988. Measurement of the false positive rate in a screening programa for human immunodeficiency virus infections. New England Journal of Medicine.319:961-964.

5).        S. Weiss,  S.H., Goedert, J.J., Sarngadharan, M.G. et.al. 1985. Screening test for HTLV–III (AIDS agent) antibodies. JAMA. 253:221-225.

6).        Biggar, R.J., Gigase, P.L., Melbye, M. et.al. 1985. ELISA HTLV retrovirus antibody reactivity associated with malaria and immune complexes in healthy Africans. Lancet. II:520-523.

7)            O’Hara, C.J., Groopman, J.E., Federman, M. 1988. The ultra structural and immunohistochemical demonstration of viral particles in lymph nodes of human immunodeficiency  virus related lymphadenopathy syndromes. Hum.Path. 19:545.

8).        Hart, C., Spira, T., Moore, J. et.al. 1988 Direct detection of HIV RNA expression in seropositive subjects. Lancet. II:596-599.

9).            Genetics of RNA tumour viruses. 1973. p656-699. In: The molecular biology of tumour viruses. J. Tooze (Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York.

10).            Simmonds, P., Balfe P., Peutherer, J.F. et.al. 1990. Human immunodeficiency  virus infected individuals contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low copy numbers. J.Virol. 64:864-872.

11).      Tu, XM, Litwak, E., Pagano, M. Issues in human immunodeficiency virus (HIV) screening programs. American Journal of Epidemiology, 1992. 136(2):244-55.