Estrazione in Fase Solida (SPE)

L’estrazione per adsorbimento è un processo fisico tra una fase solida e una fase liquida in cui la fase solida ha una affinità maggiore per il composto da isolare rispetto al solvente in cui lo stesso composto è sciolto. Quando il campione passa attraverso la fase solida gli analiti vengono concentrati sulla superficie del materiale adsorbente mentre gli altri composti presenti nel campione eluiscono senza interagire. Il risultato è la purificazione e la concentrazione delle sostanze isolate dal materiale adsorbente. Ciò può essere ottenuto grazie ad interazioni specifiche tra i gruppi funzionali dei composti e il substrato della fase solida.

La fase solida adsorbente viene impaccata in una cartuccia. Il campione viene fatto passare attraverso la cartuccia in modo che i diversi composti in esso presenti possano interagire con la superficie adsorbente venendo trattenuti o meno a seconda della loro capacità di stabilire interazioni.

Si ha ritenzione quando la fase solida riesce ad immobilizzare alcuni dei composti presenti nel campione; la ritenzione cambia in funzione del tipo di adsorbente o del solvente utilizzato.

#Eluizione è il processo di rimozione delle sostanze isolate dall’adsorbente mediante il passaggio nella cartuccia di un opportuno solvente (da usare nel minor volume possibile).
Maggiore è l’interazione tra adsorbente e analita, minore è il rischio che questo venga eliminato dalla cartuccia durante le fasi di lavaggio utilizzate per eliminare molecole interferenti coadsorbite.

Unità di misura per caratterizzare ritenzione ed eluizione è la quantità di solvente necessario per riempire gli interstizi tra particelle di adsorbente e tutti i pori presenti nella fase stazionaria della cartuccia di estrazione (bed volume).
Adsorbenti di 40 µm con pori di circa 60 Angstroms hanno un “bed volume” di circa 120 µl per 100 mg di adsorbente.
La ritenzione è considerata sufficientemente forte quando possono passare 20 bed volumes di solvente di lavaggio senza determinare l’eluizione degli analiti isolati. Una eluizione ottimale richiede non più di 5 bed volumes di solvente di estrazione.

Il flusso del campione attraverso la cartuccia durante la fase di estrazione non deve essere superiore ai 5-10 mL/min per 100 mg di adsorbente

#Capacità dell’adsorbente è la quantità di analita trattenuta da una determinata quantità di adsorbente in condizioni ottimali; varia in funzione degli adsorbenti.
Adsorbenti a scambio ionico hanno capacità di 0,5-1,5 meq/g. Per altri adsorbenti la capacità varia tra l’1 e il 5% della massa dell’adsorbente (es. 100 mg di adsorbente trattengono fino a 5 mg di analiti).

#Selettività è la capacità dell’adsorbente di distinguere tra sostanze da isolare e interferenti da allontanare. Dipende dalla struttura chimica dell’analita da isolare, dalle proprietà dell’adsorbente e dalla composizione della matrice del campione.
La selettività è massima quando l’adsorbente interagisce solo con i gruppi funzionali dell’analita, assenti negli altri componenti della matrice del campione.

#Solvatazione [interazione tra gli ioni di un soluto e le molecole del solvente, possibile solo con solventi polari (es. NaCl in acqua, gli ioni Na+ attirano le molecole di H2O)].
La solvatazione dell’adsorbente è necessaria prima che questo interagisca con le sostanze da isolare, l’adsorbente viene bagnato mediante il passaggio di diversi volumi di un solvente come il metanolo (ma anche acetonitrile, isopropanolo o THF), che viene a sua volta allontanato (anche se non completamente) mediante passaggio del solvente che prepara l’adsorbente al passaggio del campione. Una volta avvenuta la solvatazione, l’adsorbente non deve essere lasciato essiccare (bastano 30 secondi di contatto con l’aria perché l’adsorbente si asciughi).

La solvatazione dell'adsorbente rende possibile il riconoscimento degli analiti

Adsorbenti Silicei
Sono tra gli adsorbenti più utilizzati, prodotti mediante reazione tra organosilani e silicati attivi (legame silil-etere). Stabili a pH variabile tra 2 e 7,5 (sopra pH 7,5 tendono a sciogliersi in soluzione acquosa; sotto pH 2 il legame silil-etere diventa labile e i gruppi funzionali cambiano le loro caratteristiche di specificità) e con tutti i solventi organici.
Sono materiali rigidi, non si gonfiano in presenza del solvente come accade per le resine di polistirene. Ciò permette l’uso successivo di diversi solventi, rendendo possibile estrazioni anche molto complesse.
La fase solida è costituita da particelle di dimensioni variabili tra i 15 e i 100 µm, di forma irregolare o sferica, permette un flusso rapido del solvente in condizioni di vuoto minimo.
La porosità degli adsorbenti è di circa 60 Angstroms, adeguata a composti con peso molecolare attorno a 15.000. Molecole di dimensioni maggiori sono escluse dai pori e non vengono trattenute.
Le proprietà di ritenzione degli adsorbenti silicei sono dovute soprattutto ai gruppi funzionali legati al substrato di silice, alla polarità del substrato e ai silanoli rimasti liberi sulla sua superficie. Interazioni secondarie tra substrato e analita sono in funzione della polarità che permette o meno la formazioni di legami idrogeno tra i silanoli e i gruppi amminici o i gruppi -OH degli analiti in presenza di un solvente non-polare.
In condizioni acquose i gruppi silanoli producono delle interazioni ioniche con eventuali gruppi ionici degli analiti (es. con ammine protonate).

Interazioni Non-polari
Le interazioni non polari più importanti che possono intercorrere tra fase adsorbente e analita, sono le forze di Van der Waals (interazioni tra i gruppi C-H di analita e adsorbente).
C18 (Octadecil-silano) è l’adsorbente più usato per le interazioni non-polari, non è selettivo e permette di trattenere molti composti non polari. Utilizzato per isolare composti anche molto diversi soprattutto in analisi che necessitano l’estrazione del maggior numero di composti presenti all’interno di una matrice (es. analisi ambientali).
Le interazioni non-polari e la ritenzione sono facilitate in presenza di solventi molto polari (come l’acqua). In presenza di questo tipo di solventi anche molecole che presentano gruppi funzionali polari ma che hanno una struttura non polare possono interagire con l’adsorbente non-polare. Solventi non-polari invece interferiscono con i meccanismi di ritenzione.
L’eluizione degli analiti isolati deve avvenire tramite un solvente non-polare, in grado di rompere le interazioni non-polari tra analita ed adsorbente.

Caratteristiche degli analiti: composti con catena achilica, aromatica, aliciclica o altri gruppi funzionali con una struttura idrocarburica significativa.

Interazioni Polari
Interazioni polari come i legami idrogeno, forze dipolo/dipolo e molte altre che determinano la distribuzione degli elettroni tra gli atomi presenti nei gruppi funzionali producendo una una distribuzione polare delle cariche (+) e (-).
Molecole con gruppi funzionali polari (-OH, -NH2, C=O, anelli aromatici, gruppi sulfidrili, doppi legami e gruppi che contengono eteroatomi come O, N, S, P) interagiscono con i gruppi funzionali polari di opportuni adsorbenti.
Il legame idrogeno è una interazione polare che interviene tra un gruppo che ha un H legato ad un atomo elettronegativo (come l’O oppure l’N) e un altro gruppo con un atomo elettronegativo.
–OH ed –NH2 sono i principali donatori di legami idrogeno in grado di interagire con gruppi funzionali che contengono O, N e S.

Interazioni polari sono tipiche degli adsorbenti silicati (ammine e gruppi ossidrili sono i gruppi funzionali più sensibili). La ritenzione è facilitata in presenza di un solvente non-polare, l’eluizione viene eseguita con solventi polari in grado di rompere le interazioni polari tra adsorbente ed analita.

Caratteristiche degli analiti: molecole contenenti gruppi funzionali con dipoli, inclusi gruppi con etero-atomi o gruppi con proprietà di risonanza come anelli aromatici.

Interazioni Ioniche
Interazioni di scambio ionico tra analiti con gruppi carchi (+) o (-) e gruppi funzionali dell’adsorbente di segno opposto.
- Gruppi cationici (+) ammine (I, II, III, IV), ioni Ca2+, Na+, Mg2+
- Gruppi anionici (-) gr.carbossilici, -SO2OH, fosfati, sali dell’acido fosforico
Perché avvenga la ritenzione, il solvente deve avere un pH che permetta sia all’analita sia ai gruppi funzionali dell’adsorbente di essere carichi, non deve avere specie ioniche con la stessa carica dell’analita. E’ necessario conoscere la pKa di ogni gruppo.
(pKa= il pH al quale metà delle molecole in soluzione sono cariche).

La matrice del campione
Nel campione, oltre alle sostanze da isolare sono presenti molti altri composti. L'insieme di queste sostanze costituisce la matrice.
Lo sviluppo di un metodo di estrazione efficace deve dunque tener conto sia delle caratteristiche della matrice sia di quelle del composto da isolare.
Le proprietà dell’analita condizionano la scelta del tipo di adsorbente e del solvente necessario all’eluizione, ma si deve tener conto anche delle interazioni tra matrice ed adsorbente, perché alcuni composti sono in grado di competere con i siti di interazione per gli analiti, riducendone di fatto la ritenzione.
Si deve valutare il pH, il carattere polare o non polare, la forza ionica delle specie presenti, ma anche l’eventuale adsorbimento dell’analita da parte del sedimento o il legame con proteine.
Per ovviare all’adsorbimento da parte del sedimento si può procedere all’ estrazione mediante soxhlet.
Quando l’analita è legato ad una proteina i sui siti attivi non sono più disponibili e le dimensioni delle proteine ne escludono la ritenzione da parte dei normali adsorbenti. Per separare l’analita dalla proteina si può cambiare il pH del campione (spesso la variazione del pH modifica le caratteristiche delle proteine), aggiungere agenti in grado di denaturare la proteina (urea, o reagenti organici come metanolo o acido formico), far precipitare le proteine aggiungendo acetonitrile (o acido sulfosalicilico, ac.tricloroacetico, ac.perclorico).
Se nella matrice vi è un’elevata concentrazione di sali è preferibile un estrazione non-polare.
Rimuovere selettivamente i più importanti interferenti presenti nella matrice impiegando anche diverse tecniche di estrazione una di seguito all’altra.

Sviluppo del metodo

Sono due gli approcci alle tecniche di estrazione:
- ritenzione degli analiti da isolare mediante eluizione selettiva degli interferenti (+ usata)
- ritenzione degli interferenti da parte dell’adsorbente ed eluizione diretta degli analiti

Per lo svilppo di un metodo di Estrazione sono necessari:
1. Valutazione delle caratteristiche dell’analita e dei composti presenti nella matrice del campione.
2. Scelta dell’adsorbente
3. Testare l’adsorbente per valutare efficienza, selettività, tipo di eluizione.
4. Verifica del metodo di estrazione su campione reale.

1. Valutazione delle caratteristiche dell’analita e dei composti presenti nella matrice del campione
a) scopo del metodo.
- Quale livello di purezza è richiesto per l’analita?
Se l’analisi del campione viene condotta con metodi molto selettivi come analisi in GC/MS, l’estrazione può limitarsi ad una semplice ripulitura del campione dai maggiori interferenti presenti nella matrice; se l’analisi finale è meno selettiva, la procedura di estrazione deve necessariamente essere più specifica.
- Quale concentrazione finale è richiesta per l’analita?
La quantità di solvente necessario all’eluizione dell’analita varia in funzione della quantità di adsorbente utilizzato e del tipo di estrazione. Maggiore è la quantità di analita atteso, maggiore deve essere la quantità di adsorbente necessario per la sua ritenzione.
- Qual è la composizione dell’isolato?
Per isolato si intende il complesso delle sostanze ritenute dall’adsorbente, tra queste ci possono essere sostanze anche molto diverse tra di loro.
b) valutazione dell’isolato.
Struttura delle molecole presenti nell’isolato (presenza di O, N, P, S). Presenza di gruppi polari e loro eventuale dislocazione nella molecola. Presenza di ammine o gruppi ossidrili. Presenza di gruppi ionizzabili, eventuale carica, pKa. In quali solventi sono solubili. Valutazione degli effetti del pH sulla solubilità e sulla stabilità delle molecole. Valutare se le molecole sono libere in soluzione nella matrice.
c) valutazione della matrice.
Stato fisico (liquido, gas o solido). Valutare se è prevalentemente acquosa, non-polare o è un solvente organico. Trattamento prima dell’analisi (eventuali diluizioni o altri pretrattamenti). Presenza di composti interferenti (grassi, proteine) e grado di somiglianza con l’analita da isolare.

2. Scelta dell’adsorbente
Se l’analita ha regioni della molecola che contengono solo legami C-H, catene alchiliche, anelli aliciclici, aromatici o gruppi insaturi può essere ritenuto mediante interazioni non-polari.
Se l’analita presenta atomi con una forte attività polare si devono usare interazioni polari.
La presenza di ammine o gruppi –OH permette la formazione di legami idrogeno.
Si deve valutare la solubilità dell’analita sia per valutare qual è il solvente migliore per la sua eluizione, sia per rimuovere gli interferenti senza eluire l’analita.
Analiti NON-polari sono solubili solo in solventi non-polari come l’esano, ma questo potrebbe rendere difficile l’eluizione da un adsorbente non-polare. Valutare la solubilità al variare del pH o la tendenza al legame con proteine nei campioni biologici.

Possibili interferenti presenti nella matrice:
- in estrazioni non polari la presenza di sostanza grasse che possono essere adsorbite limita il fattore di ritenzione per l’analita;
- in estrazioni per scambio ionico la presenza di specie ioniche (Sali);
- la presenza di specie polari in estrazioni polari;
- tensioattivi;
- proteine in grado di interagire con l’analita da isolare.

3. Testare l’adsorbente
a) Ottimizzare la ritenzione degli standard. Per preparare gli adsorbenti si fa passare attraverso la cartuccia prima un solvente di solvatazione adeguato (1 o 2 volte il volume della colonna) in modo da attivare l’adsorbente, poi un secondo lavaggio per eliminare il solvatante.
Per una estrazione non-polare si eluisce con 10-20 volumi della stessa soluzione in cui è sciolto lo standard (miscela acquosa o acquoso/organica); per una estrazione polare si eluisce con la stessa quantità dello stesso solvente organico in cui è sciolto lo standard; per una estrazione per scambio ionico occorre equilibrare l’adsorbente in modo da raggiungere il pH desiderato.
Se le cartucce sono state esposte all’aria si può introdurre anche un prelavaggio con il solvente che verrà utilizzato per l’eluizione degli analiti, in modo da allontanare eventuali contaminanti.
Se si usa silice come adsorbente, il prelavaggio non è necessario.
Una volta attivata la cartuccia non si deve lasciarla asciugare.

b) Ottimizzare l’eluizione degli standard (cioè trovare il solvente che eluisce l’isolato con il minor volume possibile) ed identificare i solventi per il lavaggio (cioè quei solventi che non eluiscono l’analita, ma che permettono di eliminare gli interferenti presenti nella matrice).
- solventi di eluizione. Testare diversi solventi, raccogliere l’eluato e scegliere solo quei solventi che permettono un recupero superiore al 90%
- solventi di lavaggio. Testare diversi solventi (con polarità opposta a quella dell’analita), raccogliere l’eluato e scegliere quello che rimuove la maggior parte della matrice senza eluire l’analita.

c) Testare la matrice.

d) Testare l’adsorbente. Scegliere tra un set di adsorbenti con polarità differenti quello più adatto per la ritenzione dell’analita.

Fonti
- Sorbent Extraction Technology di D.D.Blevins, M.F.Burke, e altri; edited by N.Simpson e K.C.Van Horne - Varian